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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】急！克隆快做了一个月了，就是做不出来
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nutplay

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】急！克隆快做了一个月了，就是做不出来 已有20人参与

TA 克隆
载体：pMD 18-T(Takara)
感受态：DH5a (天根)
实验流程是基本按照分子克隆上说的
PCR产物做了纯化，由于浓度比较低，所以
载体：0.5ul
PCR产物：4.5ul
Solution I: 5ul
14-16°连接过夜
转化用100ul的感受态细胞
热激什么的都没有问题，复苏后浓缩成100ul全部涂板，但是就是不长东西。做了阳性对照，也没长。好奇怪啊，不知道是哪里出了问题。
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1楼 2010-12-28 13:35:28
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小晓

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
rainwander(金币+2):鼓励积极参与~~~ 2011-01-01 00:57:45
你用什么酶做的PCR?确定末端有A吧？
主要就三个点关键：
1.感受态的效率，这个可以转个质粒看看，计算下效率有多高；
2.载体和片段质量，载体不要反复冻融，要不然末端被破坏了，保证载体浓度；回收的片段检测下浓度，片段浓度低于100ng/ul 肯定不大好
3.载体和片段连接比例，这个参考手册上的吧 一般是片段高点效果好
赞一下(2人) 回复此楼
做最好的自己
14楼2010-12-30 12:37:32
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+2):鼓励 2010-12-28 19:42:26
先转个空质粒看看感受态是否有问题先。
如果感受态没问题，阳性对照都不长，应该要考虑盒子的问题了。
再就是你的片段多大？超过3K，pMD18-T连起来就有点难度了。

[ Last edited by susizheng on 2010-12-28 at 14:09 ]
赞一下(2人) 回复此楼
Thank-you，so-blue.
2楼2010-12-28 14:08:49
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nutplay

新虫 (初入文坛)
片段1700多bp，正常大小，做了阳性对照的，还是没有长，换过好几个感受态了，以前用过人家做过能做出来的感受态也不长，崩溃啊~~~
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3楼2010-12-28 14:18:43
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lhwei1987

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2011-01-01 00:57:10
连接时间可以加长试试，我上次一个2000的连接20小时才筛出来
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2010-12-28 15:26:09
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