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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于cloning几个简单的问题，希望大家帮忙
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alexguo221

金虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】关于cloning几个简单的问题，希望大家帮忙 已有6人参与

最近在做cloning，用的vector是pRSETA和pET21A用bam1酶切，想割胶回收作为重组质粒的载体。酶切的结果是两个质粒都有两条很亮的条带，而且靠的很近。这是什么情况？我改切哪一条？
还有在做ligation的时候老板叫我用去磷酸化酶事先处理下vector，这是为什么，能有什么效果。
非常感谢
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世道再难，也要呼吸顺畅。
1楼 2010-12-20 21:54:15
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
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lstt09nk(金币+2):鼓励交流 2010-12-20 22:23:09
1、跑电泳有没有做个酶切前的对照？两条带，可能是没有切干净哦~~
2、这是个很基础的问题，单酶切在连接的时候很容易自连，载体去了磷酸，自连成键的基础就没有了
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2楼2010-12-20 22:02:38
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sutao1979

木虫 (著名写手)

小木虫10年groupleader
★
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引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-20 22:02:38:
1、跑电泳有没有做个酶切前的对照？两条带，可能是没有切干净哦~~
2、这是个很基础的问题，单酶切在连接的时候很容易自连，载体去了磷酸，自连成键的基础就没有了

absolutely right,back up
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会当凌绝顶，一览众山小
3楼2010-12-20 22:16:24
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xiezhenrong

金虫 (正式写手)

北斗星
★
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载体很可能没有完全酶切，减少酶切载体的量切一下看，单酶切的载体一般要去磷酸化是防止载体自连的
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海阔凭鱼跃，天高任鸟飞！
4楼2010-12-20 22:34:38
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alexguo221

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by alexguo221 at 2010-12-20 21:54:15:
最近在做cloning，用的vector是pRSETA和pET21A用bam1酶切，想割胶回收作为重组质粒的载体。酶切的结果是两个质粒都有两条很亮的条带，而且靠的很近。这是什么情况？我改切哪一条？
还有在做ligation的时候老板叫 ...

那我应该选哪一条带呢。谢谢。
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世道再难，也要呼吸顺畅。
5楼2010-12-21 14:55:36
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zgb1982

木虫 (正式写手)
★
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你把没有酶切的质粒一起跑做为对照就知道切哪个了，如果载体本身没有切下大片段的话，应该是上面那条吧
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6楼2010-12-21 15:34:45
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alexguo221

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by zgb1982 at 2010-12-21 15:34:45:
你把没有酶切的质粒一起跑做为对照就知道切哪个了，如果载体本身没有切下大片段的话，应该是上面那条吧

恩，非常感谢你
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世道再难，也要呼吸顺畅。
7楼2010-12-21 15:50:09
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mlw8486

银虫 (正式写手)
★ ★ ★
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silicare(金币+2):谢谢参与 2010-12-22 12:03:05
去磷酸化主要是为要了让载体不自连
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justsoso......
8楼2010-12-22 09:57:34
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