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[交流]
【求助/交流】请教达人：想找出两个细菌中差异表达的基因，有什么成熟且便宜的方法？
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| 现有两株细菌，暂命名为1和2，其中2对于某种抗逆环境具有更高的抵抗力，现在想找出在这种环境下两个菌株差异表达的基因，不知有什么办法？其中菌1已经完成了基因组测序，菌2未测序，由于经费有限，不太可能采用全基因组芯片方法，请教各位达人，有什么既便宜又比较成熟的方法？不胜感激！ |
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brightfuture01
木虫之王 (文坛精英)
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10楼2010-12-08 08:41:10
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qinjysdu(金币+2):谢谢参与
rainwander(金币+2):鼓励积极参与~ 2010-12-08 08:15:07
qinjysdu(金币+2):谢谢参与
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Non-radioactive RNA fingerprint procedure First strand cDNA synthesis was performed with 15 mg of total RNA, 500 pmol oligo(dT)18 and 800U Superscript II reverse transcriptase (Life Technologies) in a volume of 100ml RT buffer, following the manufacturer’s instructions. After heat inactivation of reverse transcriptase and RNase A digestion, reaction products were purified from excess oligonucleotides by using a QIAquick kit (Qiagen). cDNA derived from 75 ng of total RNA was used as template for PCR. Amplification was performed in 20 ml of PCR buffer (10mM Tris-Cl pH 8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2) with 125mM dNTPs (Pharmacia) and 1mM each primer. For each reaction, two 18-mer oligonucleotides, of arbitrary sequence and a GC content of 61%, were used. Sequences of all 131 oligonucleotides used in this screen can be obtained upon request. All PCR amplifications were performed on an Omni-Gene thermal cycler (Hybaid). After 2 min of denaturation at 948C, 2 units of Taq DNA polymerase (Roche) were added (manual ‘hot start’). After 1 min at 948C, the profile was started with two, low-stringency cycles (948C for 1.5 min, 508C for 3.5 min and 728C for 3 min) followed by 35–40 high-stringency cycles (948C for 1 min, 658C for 1 min, and 728C for 1 min), and a final 5 min extension at 728C. Reaction products were separated on 2% SeaKem LE agarose gels (FMC) for 3.5 h at 6– 7Vcm21 and 88C. Gel and running buffer was 0.5X TBE (50mM Tris-borate pH 7.9, 1mM Na2-EDTA) containing 5mgml21 ethidium bromide. Bands of interest were excised, DNA was eluted with a Jetsorb kit (Genomed) and the amplicons were cloned directly by using a Topo TA cloning kit (Invitrogen). 这种方法比较的原始，应该比较的便宜 |
5楼2010-12-08 04:32:53
