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wangdandelia木虫 (正式写手)
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【求助/交流】DNA片段连接的温度和反应条件 已有5人参与
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DNA连接反应的温度和条件各是多少啊？上网也没查到相关的具体说明，比如说： 1. 粘末端之间的连接体系和反应条件； 2， 平末端之间的连接体系和反应条件； 3，载体与大片段之间的连接体系和反应条件； 4， 载体与小片段之间的连接体系和反应条件。 听说是4摄氏度适用于任何片段的连接，可是我觉得4摄氏度温度太低，那样的话分子的运动也缓慢，不适合连接啊。 我用的是NEB公司的 T4 DNA 连接酶。 [ Last edited by wangdandelia on 2010-11-19 at 10:46 ] |
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T4说明书上这样写的： 为方便起见，连接反应可以在室温（20-25 ℃）条件下进行。粘性末端连接：在 20 μl反应体系中加入 1 μl T4 DNA 连接酶，反应 10 分钟。平齐末端连接：在 20 μl 反应体系中加入 1 μl T4 DNA连接酶反应 2 小时，或者加入 1 μl 高浓度 T4 DNA 连接酶反应 10 分钟。 NEB 快速连接试剂盒 [NEB #M2200S（30 次反应），或 NEB #M2200L（150 次反应）] 可在室温下 5 分钟内完成平齐和粘性末端的连接。 NEB的酶我一般是用16度连接过夜，没啥问题的。 |
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