| 查看: 4809 | 回复: 11 | ||||
baijing114铁虫 (初入文坛)
|
[交流]
【求助/交流】MBP融合蛋白的Amylose亲和层析
|
请问有没有人做过关于MBP融合蛋白的Amylose亲和层析的实验啊？我现在做老是纯化不出来， 这个图是我做的成功的时候，就一条目的条带. 这个图是我纯化不出来的电泳图，有很多杂带，这两次实验条件什么的都没变，现在再也做不成功了，请教一下大家是什么原因[ Last edited by baijing114 on 2010-10-14 at 14:20 ] |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 有价值的生物经验贴 |
» 猜你喜欢
含氟糖皮质激素的外用抗炎利器醋酸氟轻松
已经有0人回复
-
阿莫奈韦（Amenamevir）：解旋酶-引物酶靶向分子的结构特征与合成路径全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有274人回复
-
利瑞鲁单抗：靶向KIR的NK细胞检查点工具抗体，结构基础与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- E.coli 融合蛋白表达一定要看看这篇 Nature 上的文章！
已经有530人回复
- 关于GST亲和层析的几点疑惑？
已经有5人回复
- 进行羟胺裂解后，进行蛋白的二次过亲和层析住纯化问题！！！！求助啊 ！！！
已经有9人回复
- 亲和层析blue sepharose 6 Fast Flow 纯化羰基还原酶的问题
已经有5人回复
- 【求助/交流】胰蛋白酶抑制剂琼脂糖凝胶 PTI 亲和层析柱的应用
已经有4人回复
- 【求助/交流】MBP融合蛋白活性低？
已经有10人回复
dianaofyezi
金虫 (正式写手)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 1660.1
- 散金: 26
- 帖子: 721
- 在线: 67.1小时
- 虫号: 371239
- 注册: 2007-05-14
- 性别: MM
- 专业: 免疫生物学
2楼2010-10-14 15:41:46
王会征
铁杆木虫 (著名写手)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 9656.2
- 散金: 6
- 红花: 8
- 帖子: 1066
- 在线: 244.3小时
- 虫号: 470121
- 注册: 2007-11-29
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
3楼2010-10-14 17:24:27
月月大可
木虫 (著名写手)
- MolEPI: 3
- 应助: 13 (小学生)
- 金币: 3272.1
- 散金: 1393
- 红花: 17
- 帖子: 1674
- 在线: 295.7小时
- 虫号: 549127
- 注册: 2008-04-20
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
★ ★ ★
lstt09nk(金币+3):鼓励下` 2010-10-14 19:23:36
baijing114(金币+10):谢谢您的指点，我想进一步向您请教一下，看看我到底哪一步实验出了问题 2010-10-15 09:51:53
lstt09nk(金币+3):鼓励下` 2010-10-14 19:23:36
baijing114(金币+10):谢谢您的指点，我想进一步向您请教一下，看看我到底哪一步实验出了问题 2010-10-15 09:51:53
|
偶前一段时间试了一次MPB标签的纯化，相对于我以前使用的His标签它的结合能力确实有点低，但是纯化出来后确实很纯。 亲和层析很需要注意的一点是目的蛋白的量和层析填料使用的比例要适当。填料承载蛋白的量如果远远大于你的蛋白，这样咋蛋白相对就容易挂上去了。 MBP层析时记得看看说明书上的流速，我印象中好像它是要求高流速的，流速低了咋蛋白也容易挂上去。 填料使用时间长了最好进行较为彻底的清洗。 如果你的蛋白纯化出来浓缩过，那么给人的感觉就是蛋白的纯度会降低。 另外不要太期望着通过一次亲和层析就获得高纯度的蛋白，除非你使用蛋白酶进行酶切。 |
4楼2010-10-14 19:07:59
baijing114
铁虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 61.6
- 散金: 32
- 帖子: 10
- 在线: 7.1小时
- 虫号: 424180
- 注册: 2007-07-21
- 性别: MM
- 专业: 生物化学
lstt09nk:想让大可看到的话，最好引用他的帖子 2010-10-15 11:16:27
|
我具体的实验过程是：培养200ML菌，诱导完离心，用20ML的裂解缓冲液重悬（该裂解缓冲液也即过柱缓冲液 20mM Tris-Hcl ph7.4，0.2M Nacl, 1mM EDTA PH8.0 ,1mM DTT), 超声破碎菌体后离心，12000r, 20min ,取上清上柱。 过柱过程中，有一次流速很快，结果效果很不好，就是上图，后来我设流速很慢，结果也不好，和流速很快的时候差不多。 我在4度层析柜里做的。 过柱子的过程就是按说明书做的。 不知道我的实验出了什么问题，请做过该实验的高手看看实验设计上有什么问题 |
5楼2010-10-15 10:11:12
6楼2010-10-26 16:07:18
jianhuafly
铜虫 (小有名气)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 68.2
- 散金: 140
- 红花: 4
- 帖子: 257
- 在线: 118.7小时
- 虫号: 712281
- 注册: 2009-03-01
- 专业: 微生物生理与生物化学
7楼2011-05-08 17:22:42
月月大可
木虫 (著名写手)
- MolEPI: 3
- 应助: 13 (小学生)
- 金币: 3272.1
- 散金: 1393
- 红花: 17
- 帖子: 1674
- 在线: 295.7小时
- 虫号: 549127
- 注册: 2008-04-20
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
8楼2011-05-09 12:42:50
jianhuafly
铜虫 (小有名气)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 68.2
- 散金: 140
- 红花: 4
- 帖子: 257
- 在线: 118.7小时
- 虫号: 712281
- 注册: 2009-03-01
- 专业: 微生物生理与生物化学
9楼2011-05-09 13:29:08
10楼2012-11-23 11:33:36
