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bioinfuture铁虫 (小有名气)
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[交流]
【求助/交流】小鼠脾淋巴细胞悬液制备求助——用于做流式细胞
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小弟想要做小鼠脾淋巴细胞的CD3/4/8染色，现在在制备脾淋巴细胞遇到瓶颈 上流式机，遇到的问题是，FSC/SSC象限图，找不到的淋巴细胞群，死细胞特别多，中性粒细胞的位置也不正确。 我制备脾淋巴细胞是这样的： 取出小鼠脾 在双层200目滤网上反复研磨，得到小鼠脾细胞悬液（10ml，1640配） 1300rpm，6min（个别情况下，有些细胞未离到管底，附着在侧壁上，我用的是水平转子） 弃去上清，用1ml PBS悬起（这时，会有一团白色絮状物，有的大，有的小，用1ml枪头反复吹，吹不散，但是如果堵在枪口，可以带出来，我通常是吸出来，弃掉） 然后加ACK裂解液（自己配的，NH4CL，150mM）4ml 室温裂解5min 加1640至10ml，立刻离心 弃掉上清，用1ml 1640悬起（如果我上步的絮状物没去处干净的话，悬起还有絮状物，如果去除干净就没有了），补液体至10ml 离心 ....... 不知道，为什么每次上机，淋巴细胞群总是找的不是十分理想，要么找到淋巴细胞群，但是位置不是十分正确，和中性粒细胞群相差很远。要么干脆找不到淋巴细胞群。不知是研磨得方法不对？还是ACK红细胞裂解液使用不对？ 试验在即，小弟万分着急，望大虾帮助我解决之。 谢谢 |
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