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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】NIH3T3细胞培养
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pumpkin236

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】NIH3T3细胞培养 已有2人参与

最近老板让养NIH3T3细胞，就找熟人复苏了一瓶NIH3T3细胞，但是关于该细胞的性质不是很清楚。该熟人是用胎牛血清养的，而我再ATCC上看的描述是禁止用胎牛血清，最好用小牛血清。。。所以比较疑惑。。。
还有几个问题
1消化传代时胰酶的用量，以及消化到什么程度就可以终止消化（0.25%胰酶-0.02%EDTA）
2消化后是直接吸走胰酶直接加培养基吹打，然后分装。还是吹打后还要离心，然后再加培养基分装呢
3接种密度是多少？昨天我加入2ml的培养基吹打，然后接种了500微升到新培养瓶中，但是发现长的比较慢
3NIH3T3细胞到底什么状态才算状态好啊
急求各位用经验的高手指教下
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1楼 2010-09-14 15:35:15
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梧桐如雪

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+5):好热心啊~赞~ 2010-09-17 17:00:33
你好。之所以用小牛血清，ATCC也讲得很清楚，胎牛血清成分较小牛更多，有些因子会影响3T3细胞的正常生长或者引起变异。时间太久，我记得不太清楚了，你可以查一下。不过一开始我也是用胎牛养的，后来看了说明书就赶紧改用了。
总之我这么折腾过后也没什么大变化，还比较正常。这个细胞挺好养的，跟平时养的贴壁细胞没啥区别。T25的瓶，长80%-90%传代，用gibico或者sigma的商品化胰酶0.5-1ml都可以，时间长短。镜检看到细胞都变圆了，就终止。不镜检么就在操作台灯下观察，轻微倾斜细胞瓶时，贴壁细胞开始有沙状脱落就可以开始终止了。我是直接加培养液终止吹打的。你的胰酶配方跟我一样，所以吹打完建议离个心，因为有EDTA。不离心也可以，就是细胞会贴壁会越来越不牢。接种密度，就一传三没有什么问题，长得还比较快，密度高些么长得确实快些，它也有群体效应。至于3T3细胞什么状态算好，一是形态要对，可以跟ATCC上的图作对比，二是看细胞消化下来是否透亮，贴壁时边缘是否清晰，三是贴壁算不算牢，四是生长速度跟ATCC说明是否一致，这些很多都是靠经验，久了自然明白。如果还不能确定，那就拿个敏感药物检测下它的敏感性。
多养养，自然它就适应新环境了。除非本身种不好，你是从别人那里拿来的，这个很不好说，传了多少代了，还保不保持原有的特性，对你的实验有没有影响，这些都是个问号。如果项目真的很重要，就去ATCC买，不要抱侥幸心理，如果没那么讲究，那就将就用吧。
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2楼2010-09-17 12:26:22
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pumpkin236

铁虫 (小有名气)
太感谢你了！前天我传代时我分别用小牛和胎牛血清传了两瓶，的确长势差别不大，形状也是典型的梭形。但是分的两瓶小牛培养的，一瓶长势不好，好多死细胞，且大部分细胞呈圆形，但另外那瓶就还不错，不知道为什么。
    我还有一个疑惑，既然3t3属于好消化的细胞系，为什么非要消化时加EDTA呢，不能直接用胰酶消化么？我以前养的肝癌细胞就直接用胰酶消化的。
    总之，谢谢了，以后有关这个细胞的问题还要多请教你哦
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3楼2010-09-18 10:20:12
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