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xiaomu3811金虫 (小有名气)
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[交流]
【求助/交流】做touch down的专家能不能给小弟点建议
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各位虫友，最近我做touch down PCR，想要将牛肝菌的磷酸盐转运蛋白基因克隆出来，可试了好多次，均没有明显成功迹象。现在我心里有点着急，所以想咨询下各位虫友，大家给点建议....谢谢.... 下面是我的pcr 反应体系：taq酶 0.5 uL 10*pcr buffer 5 uL dNTP 4 u L 简并引物1（100p） 1 uL 简并引物2（100p） 1 uL 模板（50ng/uL） 1 uL 补水 37.5 uL touch down 程序是： 94度 预变性 3分钟 94度 变性 30秒 60度到57度 退火 1分钟，并每降1度循环一次 72度 延伸 1分钟 接着 94度 变性 30秒 56度到54度 退火 1分钟，并每降1度循环四次 72度 延伸 1分钟 再接着 94度 变性 30秒 50度 退火 1分钟，并在此温度循环20次 72度 延伸 1分钟 最后在72度 运行 10分钟，结束后4度保存 总共程序运行两个小时左右，我设计的是简并引物（2个正向+1个反向），想要克隆的片段是300bp和600bp， 但是电泳检测有引物二聚体，并且还有个150左右bp大小的片段，就是没有我所需要的片段。请问各位大侠，我该怎么办呀....？ |
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