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xiaomu3811

金虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】做touch down的专家能不能给小弟点建议

各位虫友，最近我做touch down PCR，想要将牛肝菌的磷酸盐转运蛋白基因克隆出来，可试了好多次，均没有明显成功迹象。现在我心里有点着急，所以想咨询下各位虫友，大家给点建议....谢谢....
下面是我的pcr 反应体系：taq酶          0.5 uL
                                          10*pcr buffer          5 uL
                                          dNTP                      4 u L
                                       简并引物1（100p） 1 uL
                                       简并引物2（100p） 1 uL
                                          模板（50ng/uL） 1 uL
                                             补水          37.5 uL

touch  down 程序是： 94度       预变性  3分钟
                  94度       变性 30秒
                  60度到57度退火 1分钟，并每降1度循环一次
                  72度       延伸 1分钟

               接着 94度       变性 30秒
               56度到54度    退火 1分钟，并每降1度循环四次
                  72度       延伸 1分钟

            再接着 94度       变性 30秒
               50度    退火 1分钟，并在此温度循环20次
                  72度       延伸 1分钟

            最后在72度    运行 10分钟，结束后4度保存

总共程序运行两个小时左右，我设计的是简并引物（2个正向+1个反向），想要克隆的片段是300bp和600bp，

但是电泳检测有引物二聚体，并且还有个150左右bp大小的片段，就是没有我所需要的片段。请问各位大侠，我该怎么办呀....？

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Touch Down PCR 已经有17人回复
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1楼 2010-08-15 16:07:33

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renzhesichen

铁虫 (小有名气)

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★
xiaomu3811(金币+1):谢谢参与
xiaomu3811(金币+1): 2010-08-16 09:02:12

老长时间不做实验了，纯属热心掺和，仅供参考：
touch  down 程序是： 94度       预变性  4分钟
                  94度       变性 30秒
                  60度到50度退火 30秒，并每降0.5度循环一次
                  72度       延伸 1分钟

            再接着 94度       变性 30秒
               48度    退火 30秒，并在此温度循环40次
                  72度       延伸 1分钟

            最后在72度    运行 5分钟，结束后4度保存