【分享】-三磷酸腺苷-答疑专帖，我也来玩~~ - 分子生物 - 综合其他

181楼2010-12-20 12:44:32

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zplipeng

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LZ好人，，，，大大的。。。

加油哦↖(^ω^)↗，O(∩_∩)O哈哈~

182楼2010-12-20 19:39:46

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richenim

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有两个问题要请教下LZ哦，
1、我去做流式，用长春新碱做阳性对照（10ppm，给药24h），但是结果测出来是我的药物的凋亡率不到1%，而且长春新碱的凋亡率才3%，检测的老师说细胞的状态很好，染料也染上了，我不知道问题出在哪里，可否给些指点？我在网上查到说细胞凋亡后在普通显微镜的高倍镜下观察会看到细胞空泡化，所谓的空泡化到底是啥样子哦？
2、流式做完后我想进一步做一些机理方面的，打算做凋亡通路的内源性途径，预计要做caspase-3,-9和Bcl-2,Bax四个指标，不知道这样设计合理不，还需要补充不？

183楼2010-12-30 00:12:51

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三磷酸腺苷

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dhd997(金币+5):good 2010-12-30 15:35:17

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Originally posted by richenim at 2010-12-30 00:12:51:
有两个问题要请教下LZ哦，
1、我去做流式，用长春新碱做阳性对照（10ppm，给药24h），但是结果测出来是我的药物的凋亡率不到1%，而且长春新碱的凋亡率才3%，检测的老师说细胞的状态很好，染料也染上了，我不知道 ...

第一个问题：
1、首先考查自己的模型是否已经建立好。通过染Hoechst，是否得到比较高的凋亡率（视野中，凋亡细胞/总细胞）
2、制备样品的时候是否注意规范的操作？比如：有没有收集上清中的凋亡细胞？用原培养基重悬消化的细胞的时候是否有加入终浓度为2%的BSA去保护细胞？有没有充分吹成单细胞？有没有注意避免引入EDTA……
3、试剂盒的问题。我们试过国产的试剂盒（凯基），就是做不出来东西，阳性对照都不行。后来换了进口的（贴R&D牌子的）就没有问题了
4、你是用Annexin V/PI法吧。Sub G1法不推荐……根本就不能用于研究凋亡的技术。
5、空泡状，就是看到胞体里头有好多透明小泡那种

第二个问题：
1、这个凋亡是什么通路依赖的？死亡受体通路还是线粒体通路还是都有？可以使用Cas-9和Cas-8的活性测定来分辨
2、回答了第一个问题之后再根据实际情况设计实验吧，暂时不说那么多。不然都够写个综述了……

184楼2010-12-30 11:37:10

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richenim

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Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-30 11:37:10:

第一个问题：
1、首先考查自己的模型是否已经建立好。通过染Hoechst，是否得到比较高的凋亡率（视野中，凋亡细胞/总细胞）
2、制备样品的时候是否注意规范的操作？比如：有没有收集上清中的凋亡细胞？用原培 ...

1. 之前用Hoechst染了的，凋亡率差不多30%左右吧，后来一直用的吖啶橙染色的。
2.收集了上清，消化时没有加EDTA哦，但没加BSA，检测的老师说不用加所以我就没加，样品制备应该没问题吧，检测的老师说样品几乎没什么碎片哦
3.是用Annexin V/PI法，我们这边都用的是凯基的试剂盒，效果还可以。我的试剂盒是7月份买的，检测时细胞的含量大约10的六次方，加了200ul binding buffer,8ul Annexin V和5ul PI
4.请问你有没有细胞空泡状的图片啊？恕我愚笨，我实在是不知道哦！
5.我要做的是线粒体通路，我是选用了caspase-3,-9和Bcl-2,Bax四个指标，Bcl-2家装相关的蛋白，我查文献有的选了Bcl-2,Bax,Bcl-xL,Bak;有的选了Bcl-2,
Bax,Bad,Bid;我个人觉得是做了Bcl-2,Bax就没必要再做Bcl-xL,Bak了，LZ认为呢？

185楼2010-12-30 16:28:19

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三磷酸腺苷

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Originally posted by richenim at 2010-12-30 16:28:19:

1. 之前用Hoechst染了的，凋亡率差不多30%左右吧，后来一直用的吖啶橙染色的。
2.收集了上清，消化时没有加EDTA哦，但没加BSA，检测的老师说不用加所以我就没加，样品制备应该没问题吧，检测的老师说样品几乎 ...

反正我们用凯基的就做不出来东西，可能是货物批次间不稳定吧…………

空泡的图片我没有……网上搜应该能搜到

凋亡通路不是你想做什么通路就做什么，要实事求是，看看在你的模型中到底是什么机制……

186楼2010-12-30 17:13:45

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richenim

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Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-30 17:13:45:

反正我们用凯基的就做不出来东西，可能是货物批次间不稳定吧…………

空泡的图片我没有……网上搜应该能搜到

凋亡通路不是你想做什么通路就做什么，要实事求是，看看在你的模型中到底是什么机制……

你说的那个进口的凋亡试剂盒多少钱啊？
我的先导化合物主要是线粒体凋亡通路，所以我自己合成的化合物想探讨线粒体凋亡通路机制哦

187楼2010-12-30 17:23:35

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wangdandelia

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我也要举手提问。
我做的是质粒载体与21bp的核苷酸序列重组。
我的质粒是4kb，单酶切后klenow补平，然后去磷酸化；
短DNA片段是人工合成的多聚核苷酸序列，退火，然后磷酸化，与去磷酸化的载体相连。
但是，转化之后，发现重组片段变成了2kb，怎么回事呢？
我担心是去磷酸化对质粒载体产生了影响，而且，我在实验过程中，连接转化后失败率极高。请大侠为我分析一下吧，我在这些操作中该注意哪些问题？感激涕零，我做了半年了，一直失败着呢。。。。。。

188楼2010-12-30 17:51:36

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Originally posted by richenim at 2010-12-30 17:23:35:

你说的那个进口的凋亡试剂盒多少钱啊？
我的先导化合物主要是线粒体凋亡通路，所以我自己合成的化合物想探讨线粒体凋亡通路机制哦

多少钱就真忘记了……估计2k左右吧
其实，不管是什么东西，要首先在自己的模型中确认确实是线粒体通路的才往后坐
其实很简单，测一个Cas-9的活性就搞定了。细胞色素C什么的其实可以不用测，当然想结果丰富一点可以测

189楼2010-12-30 21:36:45

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Originally posted by wangdandelia at 2010-12-30 17:51:36:
我也要举手提问。
我做的是质粒载体与21bp的核苷酸序列重组。
我的质粒是4kb，单酶切后klenow补平，然后去磷酸化；
短DNA片段是人工合成的多聚核苷酸序列，退火，然后磷酸化，与去磷酸化的载体相连。
但是，转 ...

小伙子，没搞清楚原理啊！！
载体和片段都去磷酸化了，T4怎么可能形成磷酸二酯键呢？片段不需要去磷酸化的