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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】同工酶试验中的一些问题
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小凡198807

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】同工酶试验中的一些问题 已有3人参与

下面是我查文献查到的总蛋白提取,淀粉酶同工酶和酯酶的提取方法：

总蛋白分析　茶薪菇成菇、幼菇、原基、菌丝, 雪莲菇成菇、菌丝, 各取少量, 加生理盐水, 超声波细胞粉碎机处理, 4 ℃下7 000 rpm 离心10 min , 分离上清液。取一定体积样品液(内含50μL 总蛋白) ,加入2 倍样品溶解液(2 %SDS、2 %巯基乙醇、20 %甘油、0.04 %溴酚蓝、0.02 mol/L pH 8.0 Tris - HC1 缓冲液) 于100 ℃水浴中保温3 min。聚丙烯酰胺垂直板电泳, 浓缩胶浓度为3 % , 分离胶浓度为7.5 % , 电极缓冲液为pH 8.3 的Tris - 甘氨酸电极缓冲液。在浓缩胶时, 电流稳流为12 mA , 进入分离胶后, 调至稳流18 mA。电泳结束后用45.4 %甲醇- 9.2 %冰乙酸混合液固定1 h , 用0.05 % (WPV) 考马斯亮蓝R - 250 冰乙酸甲醇水染色液染色过夜, 用5 %甲醇- 7.5 %冰乙酸混合液洗脱2～3 次。


淀粉酶同工酶分析　样品制备与上面 大致相同, 只是以双蒸水代替其中的SDS。
聚丙烯酰胺垂直板电泳, 浓缩胶浓度为3 % , 分离胶浓度为7 % , 电极缓冲液为pH 8.3 的Tris - 甘氨酸电极缓冲液, 在4 ℃下, 稳定电压20 vPcm 时电泳。电泳结束, 将胶板小心置于200 mL 0.15 molPL 的醋酸缓冲液(pH 5.0) 中, 在37 ℃保温1.5 h。倒去保温液, 用0.15 molPL 醋酸缓冲液(pH 5.0) 冲洗胶板上多余的淀粉, 然后用稀释20 倍的显色碘液染色, 胶板逐渐变成蓝色, 在蓝色背景上出现各种透明条带,即淀粉酶带。


酯酶同工酶的研究
样品制备:称取一定量的不同发育期的菌体,按1∶2 ( g/mL) 加入冰冻0. 1 mol/ L 磷酸缓冲液(pH 7. 4) ,加少许石英砂于研钵中,研磨至糊状,4 ℃中13 000 r/min 离心10 s ,取上清液,按1∶1 滴加0. 05 %溴酚蓝- 25 %蔗糖液,搅匀备用。

电泳:采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳法。分离胶浓度8. 7 % ,交联度2. 5 % ,浓缩胶浓度1. 9 % ,交联度5 %。每孔加样量30 μL ,电极缓冲液为Tris -Gly 系统(pH 8. 3) ,4 ℃下电泳,起始稳压200 V ,待溴酚蓝进入分离胶后,电压调至360 V ,电泳3 h 结束。

染色:EST 同工酶染色参照Shaw[6 ]方法进行。

固定、保存:待染色的酶带清晰后,蒸馏水漂洗,7.5 %醋酸- 30 %乙醇- 15 %甘油固定,保存,制成干片。





最后，问题就是第一个总蛋白提取里面2 倍样品溶解液(2 %SDS、2 %巯基乙醇、20 %甘油、0.04 %溴酚蓝、0.02 mol/L pH 8.0 Tris - HC1 缓冲液) 这个溶解液的配方是什么，比例多少？有相关的茶树菇总DNA提取或者同工酶试验的整体方案也行。
另外酯酶实验里面的染色方法有人知道怎么染色吗？该文献染色引用的是Starch Gel Electrophoresis of EnzymesmA Compilation of Recipes这篇文章。希望能告诉我染色方法。谢谢了。
食用菌的同工酶标记方法有的话也可以发上来啊，多谢多谢。

有哪位大哥看的懂的话告诉小弟一声，小弟不胜感激，金币是不会少的，能尽快解决的话，还是要靠各位大哥，拜谢拜谢·~·最近需要做这个实验~~
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1楼 2010-08-09 18:04:18
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看天

木虫 (知名作家)
你问题的内容太多了 吓死人了...
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戒嗔怒以养肝气，省言语以养神气，多读书以养质气，顺时令以养元气，不拘节以养大气，观天变以养灵气，莫强求规于运气。
2楼2010-08-09 18:12:21
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小凡198807

木虫 (小有名气)
只要答的出来一部分的，不用全部回答也行，有多少答多少吧~就有金币的，兄弟你帮帮忙，找个高手吧~~

[ Last edited by 小凡198807 on 2010-8-9 at 18:46 ]
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3楼2010-08-09 18:43:07
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henkally

禁虫 (著名写手)
★ ★ ★
小凡198807(金币+20):多谢高手的帮助，非常感谢 2010-08-10 19:45:25
lstt09nk(金币+3):鼓励交流~~很积极~~ 2010-08-21 13:03:34
本帖内容被屏蔽
4楼2010-08-10 09:35:01
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小凡198807

木虫 (小有名气)
其实2 倍样品溶解液(2 %SDS、2 %巯基乙醇、20 %甘油、0.04 %溴酚蓝、0.02 mol/L pH 8.0 Tris - HC1 缓冲液) 这个溶解液的配方是什么，这是问，配100ML这样的溶解液，大概每个试剂需要多少ML，这个是个问题，我一直不是很清楚，相关书籍上面的溶解液还是有所差别的。
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5楼2010-08-10 20:04:38
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ddw7

银虫 (初入文坛)
看懂了 但  我想也许我帮不上什么忙
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多多指教！
6楼2010-08-21 12:42:05
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小凡198807

木虫 (小有名气)
不一定啊，或多或少能帮上的，那你知道醋酸联苯胺染色怎么使用吗？我做这个染色的时候总是有问题~~染色时间和染色程度，而且总是没有条带··
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7楼2010-08-26 22:19:45
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看见的遗忘了

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我就是一直用这个染色办法染色的，染色的时间我一直是一个小时左右，过段时间就拿出来看看有没有新的条带出来，差不多了就用蒸馏水冲洗，然后放70ml/L的乙酸溶液里固定就行了。
亲，你的分离胶浓度8. 7 % ,交联度2. 5 % ,浓缩胶浓度1. 9 % ,交联度5 %的具体的配方是什么啊
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8楼2013-01-13 21:02:27
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