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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】NdeI/XhoI和BglII/XhoI这两对内切酶效率如何？
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wh7690703

木虫 (正式写手)
NdeI/XhoI和BglII/XhoI都双切过T-目的片段，而且都切下来了
不过有个奇怪的现象：当双切目的片段和双切表达载体连接转化后，筛阳性重组子进行双酶切验证时，总会有很多的质粒切出T-载体大小的片段。
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11楼2010-08-17 11:19:57
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★
lstt09nk(金币+2):方法不错~ 2010-08-18 12:53:55
wh7690703(金币+1): 2010-08-18 13:38:13
减少酶切不彻底的方法：分步交叉酶切，比如你用NdeI/XhoI来切，可以先分别用NdeI和XhoI单切，跑胶验证是否都能切开，如果可以，则再分别用XhoI和NdeI进行第二步酶切。
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12楼2010-08-18 12:31:38
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wh7690703

木虫 (正式写手)
单切的我都试过，而且每种单切完都是跑胶回收的，然后再用另一种内切酶进行酶切，之后再胶回收
还有，在进行第二个酶切的时候我还加入了碱性磷酸酶
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13楼2010-08-18 13:46:58
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
wh7690703(金币+1): 2010-08-18 20:29:43
wh7690703(金币+1):哦，谢谢 那我再试试。 还有，筛阳性重组子进行双酶切验证时，总会有很多的质粒切出T-载体大小的片段。请问这难道是回收目的片段不干净，含有切下来的T-载体吗？ 2010-08-18 20:32:17
是在第二步酶切的时候同时做去磷酸化吗？不建议你这么做，因为两种酶的buffer不一样，有可能会对酶的活性产生抑制
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14楼2010-08-18 17:49:41
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wh7690703

木虫 (正式写手)
请问楼上的，一般酶切几小时为好？
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15楼2010-08-18 20:30:25
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
wh7690703(金币+1):呵呵，我说的问题是这样的：不过有个奇怪的现象：当双切目的片段和双切表达载体连接转化后，筛阳性重组子进行双酶切验证时，总会有很多的质粒切出T-载体大小的片段。 即切不出表达载体片段。 2010-08-19 09:40:46
不好意，不知道你现在是装表达载体，照你这么说应该是片段没切完全，重新切一下再做吧

[ Last edited by 空谷幽风 on 2010-8-19 at 09:46 ]
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16楼2010-08-18 22:39:55
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by wh7690703 at 2010-08-18 20:30:25:
请问楼上的，一般酶切几小时为好？

常规限制性内切酶一般切2小时就可以了，fermentas的快切酶一般切10-15min，时间长了容易出现星活性
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17楼2010-08-18 22:45:25
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qingqingcao288

木虫 (小有名气)
我用过takara的这两个酶，双酶切同时进行的，很好的。
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18楼2010-08-20 20:27:58
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