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南方科技大学公共卫生及应急管理学院2025级博士研究生招生报考通知
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wh7690703

木虫 (正式写手)

NdeI/XhoI和BglII/XhoI都双切过T-目的片段,而且都切下来了
不过有个奇怪的现象:当双切目的片段和双切表达载体连接转化后,筛阳性重组子进行双酶切验证时,总会有很多的质粒切出T-载体大小的片段。
11楼2010-08-17 11:19:57
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

★ ★
lstt09nk(金币+2):方法不错~ 2010-08-18 12:53:55
wh7690703(金币+1): 2010-08-18 13:38:13
减少酶切不彻底的方法:分步交叉酶切,比如你用NdeI/XhoI来切,可以先分别用NdeI和XhoI单切,跑胶验证是否都能切开,如果可以,则再分别用XhoI和NdeI进行第二步酶切。
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
12楼2010-08-18 12:31:38
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wh7690703

木虫 (正式写手)

单切的我都试过,而且每种单切完都是跑胶回收的,然后再用另一种内切酶进行酶切,之后再胶回收
还有,在进行第二个酶切的时候我还加入了碱性磷酸酶
13楼2010-08-18 13:46:58
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

wh7690703(金币+1): 2010-08-18 20:29:43
wh7690703(金币+1):哦,谢谢 那我再试试。 还有,筛阳性重组子进行双酶切验证时,总会有很多的质粒切出T-载体大小的片段。请问这难道是回收目的片段不干净,含有切下来的T-载体吗? 2010-08-18 20:32:17
是在第二步酶切的时候同时做去磷酸化吗?不建议你这么做,因为两种酶的buffer不一样,有可能会对酶的活性产生抑制
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
14楼2010-08-18 17:49:41
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wh7690703

木虫 (正式写手)

请问楼上的,一般酶切几小时为好?
15楼2010-08-18 20:30:25
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

wh7690703(金币+1):呵呵,我说的问题是这样的:不过有个奇怪的现象:当双切目的片段和双切表达载体连接转化后,筛阳性重组子进行双酶切验证时,总会有很多的质粒切出T-载体大小的片段。 即切不出表达载体片段。 2010-08-19 09:40:46
不好意,不知道你现在是装表达载体,照你这么说应该是片段没切完全,重新切一下再做吧

[ Last edited by 空谷幽风 on 2010-8-19 at 09:46 ]
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
16楼2010-08-18 22:39:55
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by wh7690703 at 2010-08-18 20:30:25:
请问楼上的,一般酶切几小时为好?

常规限制性内切酶一般切2小时就可以了,fermentas的快切酶一般切10-15min,时间长了容易出现星活性
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
17楼2010-08-18 22:45:25
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qingqingcao288

木虫 (小有名气)

我用过takara的这两个酶,双酶切同时进行的,很好的。
18楼2010-08-20 20:27:58
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