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黎亚丽

新虫 (小有名气)

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Originally posted by hyw1989960 at 2010-08-03 09:29:23:
是不是载体问题,拿去把载体测序,看看是不是,我以前做过没表达出来,都是再提问题,

什么是再提问题?载体测序是为什么?
11楼2010-08-03 09:45:20
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黎亚丽

新虫 (小有名气)

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Originally posted by liouwzh at 2010-08-03 09:30:29:
楼主可以优化IPTG及培养温度。培养温度有点高,诱导温度一般是低于37度,有30度,25度,甚至是16度等。

好的!
12楼2010-08-03 09:45:59
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dcb005

金虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
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Originally posted by 黎亚丽 at 2010-08-03 09:43:57:

我查了一下我的基因中有信号肽,分泌到哪我还没有查到,请指教。

用signalP预测一下。另外一个就是参考一下pet 操作手册。上面有蛋白分泌定位的操作方法
★穷则独善其身,达则兼济天下★
13楼2010-08-03 09:52:21
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dcb005

金虫 (著名写手)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-08-05 06:03:30
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Originally posted by 黎亚丽 at 2010-08-03 09:09:33:

你说的是不是上清和沉淀都得用SDS-PAGE检测呢?还有怎么看基因信号肽?信号肽和蛋白分泌到胞外有关系吗啊?TCA是什么意思?

有的蛋白可溶在上清中,有的表达量太高在包涵体中,信号肽可用singnal P预测,TCA是浓缩蛋白的方法,比如要是分泌到胞外,培养基太多,蛋白PAGE根本看不出来,需要浓缩再测蛋白
★穷则独善其身,达则兼济天下★
14楼2010-08-03 09:55:03
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黎亚丽

新虫 (小有名气)

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Originally posted by dcb005 at 2010-08-03 09:55:03:

有的蛋白可溶在上清中,有的表达量太高在包涵体中,信号肽可用singnal P预测,TCA是浓缩蛋白的方法,比如要是分泌到胞外,培养基太多,蛋白PAGE根本看不出来,需要浓缩再测蛋白

谢谢!
15楼2010-08-03 10:12:11
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月月大可

木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
换用营养成分更加丰富的培养基譬如2*YT
16g蛋白胨
10g酵母粉
5g绿化纳
pH7.0
16楼2010-08-04 21:25:57
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黎亚丽

新虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2010-08-04 21:25:57:
换用营养成分更加丰富的培养基譬如2*YT
16g蛋白胨
10g酵母粉
5g绿化纳
pH7.0

hao ,谢谢
17楼2010-08-04 21:41:14
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cpu2004

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
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reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-08-05 06:03:40
你这个不是培养条件的问题,需要换载体,而且需要在你目的产物N端或C端增加融合蛋白(你可以选择标签作为融合蛋白)。即便有信号肽使得你的蛋白分泌到胞外,用全菌蛋白也是能够检测到的,因为信号肽的效率绝对是低于pET系统生产效率的,全菌检测不到蛋白一般就是不表达。还有就是你产物太小的话直接降解也是检测不到的,另外产物太小有时候考马斯是染不出来的
18楼2010-08-04 23:15:00
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cpu2004

金虫 (小有名气)

虽然蛋白质表达N端非常重要,但是也有C端导致不稳定的情况,我们实验室有一个蛋白一直表达不出来,但是在C端增加了标签才表达的
19楼2010-08-04 23:16:27
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xinyaolu

木虫 (小有名气)


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不知楼主有没有测序。建议楼主测序确认序列无移码,有完整正确的读码框,无突变的情况下。可以再尝试虫友没提出的一些建议。
20楼2010-08-06 10:31:41
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