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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】如何提高PET表达系统的蛋白表达量
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黎亚丽

新虫 (小有名气)
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Originally posted by hyw1989960 at 2010-08-03 09:29:23:
是不是载体问题，拿去把载体测序，看看是不是，我以前做过没表达出来，都是再提问题，

什么是再提问题？载体测序是为什么？
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11楼2010-08-03 09:45:20
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黎亚丽

新虫 (小有名气)
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Originally posted by liouwzh at 2010-08-03 09:30:29:
楼主可以优化IPTG及培养温度。培养温度有点高，诱导温度一般是低于37度，有30度，25度，甚至是16度等。

好的！
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12楼2010-08-03 09:45:59
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dcb005

金虫 (著名写手)
★
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Originally posted by 黎亚丽 at 2010-08-03 09:43:57:

我查了一下我的基因中有信号肽，分泌到哪我还没有查到，请指教。

用signalP预测一下。另外一个就是参考一下pet 操作手册。上面有蛋白分泌定位的操作方法
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★穷则独善其身,达则兼济天下★
13楼2010-08-03 09:52:21
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dcb005

金虫 (著名写手)
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reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-08-05 06:03:30
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Originally posted by 黎亚丽 at 2010-08-03 09:09:33:

你说的是不是上清和沉淀都得用SDS-PAGE检测呢？还有怎么看基因信号肽？信号肽和蛋白分泌到胞外有关系吗啊？TCA是什么意思？

有的蛋白可溶在上清中，有的表达量太高在包涵体中，信号肽可用singnal P预测，TCA是浓缩蛋白的方法，比如要是分泌到胞外，培养基太多，蛋白PAGE根本看不出来，需要浓缩再测蛋白
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★穷则独善其身,达则兼济天下★
14楼2010-08-03 09:55:03
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黎亚丽

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by dcb005 at 2010-08-03 09:55:03:

有的蛋白可溶在上清中，有的表达量太高在包涵体中，信号肽可用singnal P预测，TCA是浓缩蛋白的方法，比如要是分泌到胞外，培养基太多，蛋白PAGE根本看不出来，需要浓缩再测蛋白

谢谢！
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15楼2010-08-03 10:12:11
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月月大可

木虫 (著名写手)
★
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换用营养成分更加丰富的培养基譬如2*YT
16g蛋白胨
10g酵母粉
5g绿化纳
pH7.0
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16楼2010-08-04 21:25:57
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黎亚丽

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2010-08-04 21:25:57:
换用营养成分更加丰富的培养基譬如2*YT
16g蛋白胨
10g酵母粉
5g绿化纳
pH7.0

hao ,谢谢
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17楼2010-08-04 21:41:14
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cpu2004

金虫 (小有名气)
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reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-08-05 06:03:40
你这个不是培养条件的问题，需要换载体，而且需要在你目的产物N端或C端增加融合蛋白（你可以选择标签作为融合蛋白）。即便有信号肽使得你的蛋白分泌到胞外，用全菌蛋白也是能够检测到的，因为信号肽的效率绝对是低于pET系统生产效率的，全菌检测不到蛋白一般就是不表达。还有就是你产物太小的话直接降解也是检测不到的，另外产物太小有时候考马斯是染不出来的
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18楼2010-08-04 23:15:00
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cpu2004

金虫 (小有名气)
虽然蛋白质表达N端非常重要，但是也有C端导致不稳定的情况，我们实验室有一个蛋白一直表达不出来，但是在C端增加了标签才表达的
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19楼2010-08-04 23:16:27
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xinyaolu

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
不知楼主有没有测序。建议楼主测序确认序列无移码，有完整正确的读码框，无突变的情况下。可以再尝试虫友没提出的一些建议。
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20楼2010-08-06 10:31:41
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