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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】SDS-PAGE凝胶电泳
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黎亚丽

新虫 (小有名气)

nihao

★ ★ ★
看天(金币+3):呵呵 还是自己找了... 2010-07-28 09:35:22
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-07-27 18:51:29:
我说的实验原理包括跑PAGE，包括怎么获取蛋白质

有人这么说：菌体需要先用适量的水或者pbs缓冲液重悬，然后加入等体积的2xloading buffer，loadingbuffer中会包含有sds，甘油，指示剂和还原剂；
煮沸的作用是使菌体裂解，蛋白与sds，还原剂等充分作用，这样子，蛋白的二级结构，二硫键等都就会被打破，蛋白与sds结合而带负电荷，且带负电荷的比率与蛋白大小的相关，这样蛋白在电泳过程中依照大小而分离达到预想中的分离效果。

我认为：菌体悬浮于2倍的SDS-PAGE缓冲液（Tric-HCLPH6.7..SDS..甘油。。巯基乙醇），一是使蛋白质变性，一是为了使形成的包涵体可以再折叠，重新溶解。因为包涵体可以溶于缓冲液中。煮沸是变性后的复性过程。

我又一个问题我表达的蛋白会不会在这个过程变性，而不能复性了呢？
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11楼2010-07-27 20:45:16
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黎亚丽

新虫 (小有名气)
★
看天(金币+1):肯能是问题比较稍微简单 所以他们觉得你应该自己去找 呵呵 鼓励一下 常来 2010-07-28 09:37:27
引用回帖:
Originally posted by 花花贝 at 2010-07-26 19:58:02:
每隔几小时 是不是诱导时间长短
蛋白有可能是分泌到细胞外的 就要取上清  也可能在内部 就要裂解
悬浮的缓冲液没什么意义 该怎么加就怎么加
煮沸是不是要变性蛋白质
我也是新手哈哈

[ Last edited by 花 ...

我认为：菌体悬浮于2倍的SDS-PAGE缓冲液（Tric-HCLPH6.7..SDS..甘油。。巯基乙醇），一是使蛋白质变性，一是为了使形成的包涵体可以再折叠，重新溶解。因为包涵体可以溶于缓冲液中。煮沸是变性后的复性过程。

我又一个问题我表达的蛋白会不会在这个过程变性，而不能复性了呢？

有人认为：
菌体需要先用适量的水或者pbs缓冲液重悬，然后加入等体积的2xloading buffer，loadingbuffer中会包含有sds，甘油，指示剂和还原剂，煮沸的作用是使菌体裂解，蛋白与sds，还原剂等充分作用，这样子，蛋白的二级结构，二硫键等都就会被打破，蛋白与sds结合而带负电荷，且带负电荷的比率与蛋白大小的相关，这样蛋白在电泳过程中依照大小而分离达到预想中的分离效果。
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12楼2010-07-27 20:46:26
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
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看天(金币+1):终于把她急的自己去找了... 2010-07-28 09:36:14
高温煮的蛋白变性是不可逆的过程

至于其他的点
你深入去想了之后，不就自己找到答案了
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13楼2010-07-27 20:50:15
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hyw1989960

木虫 (正式写手)

快乐家族二十八
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
多看一些资料，这些书上都有。。。
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快乐家族
14楼2010-07-27 21:33:09
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烟大考研

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
看天(金币+1):知道就简单说一下 呵呵 2010-07-28 09:36:32
引用回帖:
Originally posted by 黎亚丽 at 2010-07-27 16:13:34:

我就是想测一下我的目的基因表达蛋白了没？

那你这样做是可以的，但是这样跑出来的蛋白带会比较杂，想确认是否表达，一般用Western-blot进行验证
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心信其可行，则移山填海之难，终有成功之日；心信其不可行，则反掌折枝之易，亦无收效之期
15楼2010-07-28 09:07:03
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noheartman

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3):很好，很详细~~ 2010-07-29 09:25:17
每隔几小时取菌体去做SDS-PAGE凝胶电泳是为了确定目的蛋白的最适合的表达时间，时间太短，母的蛋白表达量少，时间过长，对目的蛋白没好处，所以要确定一个合适的表达时间，蛋白产量不至于太低。SDS-PAGE凝胶电泳中样品室需要和上样缓冲液结合才能电泳的，上样缓冲液里有溴酚蓝可以做指示剂，有SDS和巯基乙醇做变性剂，因为SDS-PAGE凝胶电泳是一个变形的电泳，样品需要彻底的变性，高级结构全部被破坏，煮沸也是为了变性。做蛋白表达，一般都希望的是可溶性的表达，如果以包涵体（目的蛋白表达在沉淀里）就需要进行变性复性，而有些蛋白复性是相当困难的，这也是为什么先取上清去跑胶的原因。收集菌体后，会加入溶菌酶破碎细胞，使目的蛋白释放出来，我们拿缓冲液去悬浮，如果是可溶性表达，目的蛋白至少有一部分是在上清里面。
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16楼2010-07-28 10:18:51
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刘小乐

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
查一下sds作用原理就明白了
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互动互利互相学习
17楼2010-07-28 10:21:59
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黎亚丽

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by noheartman at 2010-07-28 10:18:51:
每隔几小时取菌体去做SDS-PAGE凝胶电泳是为了确定目的蛋白的最适合的表达时间，时间太短，母的蛋白表达量少，时间过长，对目的蛋白没好处，所以要确定一个合适的表达时间，蛋白产量不至于太低。SDS-PAGE凝胶电泳中 ...

谢谢！这下子我有点明白了。
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18楼2010-07-28 13:52:33
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黎亚丽

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by noheartman at 2010-07-28 10:18:51:
每隔几小时取菌体去做SDS-PAGE凝胶电泳是为了确定目的蛋白的最适合的表达时间，时间太短，母的蛋白表达量少，时间过长，对目的蛋白没好处，所以要确定一个合适的表达时间，蛋白产量不至于太低。SDS-PAGE凝胶电泳中 ...

我认为：菌体悬浮于2倍的SDS-PAGE缓冲液（Tric-HCLPH6.7..SDS..甘油。。巯基乙醇），一是使蛋白质变性，一是为了使形成的包涵体可以再折叠，重新溶解。因为包涵体可以溶于缓冲液中。煮沸是变性后的复性过程。
那我这样认为是不对的吧！
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19楼2010-07-28 13:53:57
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黎亚丽

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by noheartman at 2010-07-28 10:18:51:
每隔几小时取菌体去做SDS-PAGE凝胶电泳是为了确定目的蛋白的最适合的表达时间，时间太短，母的蛋白表达量少，时间过长，对目的蛋白没好处，所以要确定一个合适的表达时间，蛋白产量不至于太低。SDS-PAGE凝胶电泳中 ...

那我是没明白SDS-PAGE的作用原理？
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20楼2010-07-28 13:55:38
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