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黎亚丽

新虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】SDS-PAGE凝胶电泳已有13人参与

SDS-PAGE凝胶电泳每一步骤的作用是什么？比如：每隔几小时取出的菌体，离心，沉淀用2倍的SDS-PAGE缓冲液悬浮（意义？），煮沸（作用？）离心，取上清上样，为什么不取沉淀？为什么悬浮后不直接离心？

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1楼 2010-07-26 18:33:06

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noheartman

金虫 (小有名气)

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★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3):很好，很详细~~ 2010-07-29 09:25:17

每隔几小时取菌体去做SDS-PAGE凝胶电泳是为了确定目的蛋白的最适合的表达时间，时间太短，母的蛋白表达量少，时间过长，对目的蛋白没好处，所以要确定一个合适的表达时间，蛋白产量不至于太低。SDS-PAGE凝胶电泳中样品室需要和上样缓冲液结合才能电泳的，上样缓冲液里有溴酚蓝可以做指示剂，有SDS和巯基乙醇做变性剂，因为SDS-PAGE凝胶电泳是一个变形的电泳，样品需要彻底的变性，高级结构全部被破坏，煮沸也是为了变性。做蛋白表达，一般都希望的是可溶性的表达，如果以包涵体（目的蛋白表达在沉淀里）就需要进行变性复性，而有些蛋白复性是相当困难的，这也是为什么先取上清去跑胶的原因。收集菌体后，会加入溶菌酶破碎细胞，使目的蛋白释放出来，我们拿缓冲液去悬浮，如果是可溶性表达，目的蛋白至少有一部分是在上清里面。