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黎亚丽

新虫 (小有名气)

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专业: 植物生理与生化

[交流] 【求助/交流】SDS-PAGE凝胶电泳已有13人参与

SDS-PAGE凝胶电泳每一步骤的作用是什么？比如：每隔几小时取出的菌体，离心，沉淀用2倍的SDS-PAGE缓冲液悬浮（意义？），煮沸（作用？）离心，取上清上样，为什么不取沉淀？为什么悬浮后不直接离心？

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1楼 2010-07-26 18:33:06

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黎亚丽

新虫 (小有名气)

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★
看天(金币+1):肯能是问题比较稍微简单所以他们觉得你应该自己去找呵呵鼓励一下常来 2010-07-28 09:37:27

引用回帖:

Originally posted by 花花贝 at 2010-07-26 19:58:02:
每隔几小时是不是诱导时间长短
蛋白有可能是分泌到细胞外的就要取上清也可能在内部就要裂解
悬浮的缓冲液没什么意义该怎么加就怎么加
煮沸是不是要变性蛋白质
我也是新手哈哈

[ Last edited by 花 ...

我认为：菌体悬浮于2倍的SDS-PAGE缓冲液（Tric-HCLPH6.7..SDS..甘油。。巯基乙醇），一是使蛋白质变性，一是为了使形成的包涵体可以再折叠，重新溶解。因为包涵体可以溶于缓冲液中。煮沸是变性后的复性过程。

我又一个问题我表达的蛋白会不会在这个过程变性，而不能复性了呢？

有人认为：
菌体需要先用适量的水或者pbs缓冲液重悬，然后加入等体积的2xloading buffer，loadingbuffer中会包含有sds，甘油，指示剂和还原剂，煮沸的作用是使菌体裂解，蛋白与sds，还原剂等充分作用，这样子，蛋白的二级结构，二硫键等都就会被打破，蛋白与sds结合而带负电荷，且带负电荷的比率与蛋白大小的相关，这样蛋白在电泳过程中依照大小而分离达到预想中的分离效果。