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zemin_fang

木虫 (正式写手)

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专业: 微生物生理与生物化学

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dhd997(金币+1):热心虫友。 2010-06-23 16:11:58

16°连接2个小时就够了，主要是载体与外源片段的比例要合适，我做连接的体系是载体0.5ul，加入外源DNA与载体比例为1:5——1：10，连接buffer5ul，用水补到10ul。
还有一点是要确保你的外源片段加入了A

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11楼2010-06-23 15:07:20

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zemin_fang

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还有重要的一点，TaKaRa载体试剂盒质量不是很稳定，所以在做连接的时候一定要用盒子里的载体做对照实验，确保载体酶问题。

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12楼2010-06-23 15:09:38

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xiaoru2010

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Originally posted by 段家一凡 at 2010-06-23 12:00:00:
其实连接一般1-2小时就够了，太长可能还有副作用

以前都精确的连接2小时，菌液PCR什么都没有，连过7小时，菌液PCR有很多片段，连20小时，就是正常的很亮一条目的带。

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13楼2010-06-23 15:20:51

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Originally posted by 雪山飞狐7233 at 2010-06-23 13:31:41:
16度连接过夜（12-16h）。连接不上还应该考虑载体与目的片段之间的比例（通常是1：3-10）

我就是载体1，目的片段3，载体只多不少，PMD和PGEM都是这样

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14楼2010-06-23 15:25:05

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Originally posted by zemin_fang at 2010-06-23 15:07:20:
16°连接2个小时就够了，主要是载体与外源片段的比例要合适，我做连接的体系是载体0.5ul，加入外源DNA与载体比例为1:5——1：10，连接buffer5ul，用水补到10ul。
还有一点是要确保你的外源片段加入了A

以前都精确的连接2小时，菌液PCR什么都没有，连过7小时，菌液PCR有很多片段，连20小时，就是正常的很亮一条目的带。比例1：3

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15楼2010-06-23 15:42:25

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