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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】克隆连接时间
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zemin_fang

木虫 (正式写手)
★ ★
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dhd997(金币+1):热心虫友。 2010-06-23 16:11:58
16°连接2个小时就够了，主要是载体与外源片段的比例要合适，我做连接的体系是载体0.5ul，加入外源DNA与载体比例为1:5——1：10，连接buffer5ul，用水补到10ul。
还有一点是要确保你的外源片段加入了A
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11楼2010-06-23 15:07:20
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zemin_fang

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
还有重要的一点，TaKaRa载体试剂盒质量不是很稳定，所以在做连接的时候一定要用盒子里的载体做对照实验，确保载体酶问题。
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12楼2010-06-23 15:09:38
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xiaoru2010

引用回帖:
Originally posted by 段家一凡 at 2010-06-23 12:00:00:
其实连接一般1-2小时就够了，太长可能还有副作用

以前都精确的连接2小时，菌液PCR什么都没有，连过7小时，菌液PCR有很多片段，连20小时，就是正常的很亮一条目的带。
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13楼2010-06-23 15:20:51
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xiaoru2010

引用回帖:
Originally posted by 雪山飞狐7233 at 2010-06-23 13:31:41:
16度连接过夜（12-16h）。连接不上还应该考虑载体与目的片段之间的比例（通常是1：3-10）

我就是载体1，目的片段3，载体只多不少，PMD和PGEM都是这样
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14楼2010-06-23 15:25:05
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xiaoru2010

引用回帖:
Originally posted by zemin_fang at 2010-06-23 15:07:20:
16°连接2个小时就够了，主要是载体与外源片段的比例要合适，我做连接的体系是载体0.5ul，加入外源DNA与载体比例为1:5——1：10，连接buffer5ul，用水补到10ul。
还有一点是要确保你的外源片段加入了A

以前都精确的连接2小时，菌液PCR什么都没有，连过7小时，菌液PCR有很多片段，连20小时，就是正常的很亮一条目的带。 比例1：3
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15楼2010-06-23 15:42:25
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wzw04

铁杆木虫 (小有名气)
★
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我用的载体和你一样，不过我最长连接时间是16度6小时，最短2小时就搞定了
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16楼2010-06-23 21:39:44
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375050424

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
应该是你的片段有问题吧，我们经常用这种载体，非常容易连，过夜也是经常的事。你的片段不会是KOD扩增后没加A吧？
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17楼2010-06-23 21:58:42
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walker2898

银虫 (小有名气)
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引用回帖:
Originally posted by xiaoru2010 at 2010-06-23 11:38:25:

先四后16吗？还是4或16？一共12小时？

两个一起做啊，一个做4度，一个做16度，每个都是过夜即可。
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18楼2010-06-24 21:17:06
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weiminhb

铁虫 (小有名气)
★
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TA克隆一般连5,6个小时就够了，我上次连了2个小时就可以了
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19楼2010-06-25 10:28:20
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