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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】克隆连接时间
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xiaoru2010

[交流] 【求助/交流】克隆连接时间 已有11人参与

问一下大家做克隆的时候，一般多少度连接多长时间啊？我用的是PMD19-T载体，上次16度连了23小时，有个1000多的片段还是没连上，菌液PCR出现好多条带……PS：貌似PGEM-T载体25度时间长了什么也连不上
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1楼 2010-06-23 11:16:17
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zemin_fang

木虫 (正式写手)
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dhd997(金币+1):热心虫友。 2010-06-23 16:11:58
16°连接2个小时就够了，主要是载体与外源片段的比例要合适，我做连接的体系是载体0.5ul，加入外源DNA与载体比例为1:5——1：10，连接buffer5ul，用水补到10ul。
还有一点是要确保你的外源片段加入了A
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11楼2010-06-23 15:07:20
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walker2898

银虫 (小有名气)
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我做的连接一般是在4度和16度连接12小时，但是不是用你说的这个载体。
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2楼2010-06-23 11:19:57
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wywangying169

银虫 (小有名气)
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lstt09nk(金币+1):欢迎多多交流~~ 2010-06-23 12:35:52

以前做克隆的时候，用的载体是PMD18，一般是4度连接过夜，也就是大概14个小时左右。现在在用一个试剂盒，载体是PEASY-T3，只要连接五分钟就可以了！

[ Last edited by wywangying169 on 2010-6-23 at 14:54 ]
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好好自学，好好工作
3楼2010-06-23 11:29:22
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xiaoru2010

引用回帖:
Originally posted by wywangying169 at 2010-06-23 11:29:22:

以前做克隆的时候，用的载体是PMD18，一般是16度连接过夜，也就是大概14个小时左右。现在在用一个试剂盒，载体是PEAY-T3，只要连接五分钟就可以了！

好强的载体？单卖多少钱a?
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4楼2010-06-23 11:37:36
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