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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PFU扩不出东西来，请各路大侠帮帮小虫啊~~~~~~~
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lfgc8505

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PFU扩不出东西来，请各路大侠帮帮小虫啊~~~~~~~ 已有11人参与

最近在做PCR，因为要扩的片段比较长，1800BP.用专扩长片段的LA酶扩了，效果可以，但是测序发现有突变，因为我要求不能有突变，所以没用。改用promega的PFU后，怎么都扩不出东西来，退火温度都试了（50-65），之前用的是57度都能扩出来。
我的反应程序，是95 3分钟
                95 30秒
                50/65 30秒
                72 4分钟 30个循环
                72 10分钟
               反应体系使用的是说明书上的推荐体系。

但是就是没有我的目的条带，只有两条约800和300的杂带！

崩溃了，这马上又要回报了，还是做出来啊~请各路虫友帮帮忙啊。发表一下你们的高建啊！
小虫不胜感激！
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1楼 2010-06-17 10:13:57
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zemin_fang

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):感谢交流~~ 2010-06-17 10:49:33
LA保真性很差。
你的模板是不是降解了？如果没有，你可以换他人可以保证扩增出来的DNA做模板，进行扩增来确定你的试剂是否出问题。
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2楼2010-06-17 10:22:03
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陈思容

铜虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
这个最好附图看看，我也在用PFU做，很崩溃
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3楼2010-06-17 10:45:45
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月月大可

木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-06-17 11:59:17
加大引物浓度！！！！
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4楼2010-06-17 10:46:59
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jasco

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-06-17 11:59:26
touchdown试试看，还有就是延伸时间2min足矣
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5楼2010-06-17 11:01:20
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guangmingzhizi

铁虫 (初入文坛)
★ ★ ★
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1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-06-17 11:59:34
lmzxcom1(金币+1):能不能给新人解释多一些呢，期待 2010-06-17 16:20:40
PFU会降解你的引物的，从这方面入手来解决下吧。
赞一下(3人) 回复此楼
我的blog：http://vipbio.bokee.com
6楼2010-06-17 11:25:25
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-06-17 11:59:42
PFU对体系内要求比较苛刻。既然LA能够扩增出来，说明还是反应体系的问题。一般PFU能够提供特别的buffer，你可以试试。
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52187644
7楼2010-06-17 11:32:44
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可可猫

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
没有用过这个诶
我用的是prime star  效果还可以
但是是片段很小
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8楼2010-06-17 16:07:43
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zsxnd

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by jasco at 2010-06-17 11:01:20:
touchdown试试看，还有就是延伸时间2min足矣

这是高人！@
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9楼2010-06-17 16:24:59
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1800的片段不算大，用KOD或PBO的话1:30足够了，另外看一下突变多吗，如果只有一两个地方的话可以做一下修复，我们公司3000bp的片段都是经常扩的，效果都不错
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
10楼2010-06-17 18:26:42
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