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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR产物跑胶时加样孔很亮
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wuwo

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR产物跑胶时加样孔很亮已有21人参与

PCR产物跑胶时加样孔很亮，下面只有二聚体无目的条带，Marker正常，绝不是蛋白污染（基因组梯度稀释做过仍是，同样基因组用另一引物P的结果加样孔正常，PCR产物测DNA结果有339ng/μL，应该是P出的产物），相应条件另一酶的PCR结果正常，换了个酶后一直P出加样孔很亮，下面只有二聚体无目的带，模板梯度做了有原浓度到稀释10000倍都是，可能是哪些原因呢？


多谢各位朋友，胶浓度是1%的，Marker是5k，目的条带应该在4k
上图

[ Last edited by wuwo on 2010-7-13 at 19:23 ]
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1楼2010-06-13 19:49:49
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wuwo

铜虫 (小有名气)
多谢各位朋友，刚刚才把图上去，多谢各位能帮出出点子。
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6楼2010-07-13 19:24:43
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wuwo

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhucexiaji at 2010-07-13 20:41:59:
看这个图，如果胶浓度没问题的话，十有八九是蛋白的缘故

确实不是蛋白，PCR产物我测过DNA纯度，很高，没有蛋白……而且同样基因组其他酶P的效果完全正常
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15楼2010-07-15 09:36:21
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wuwo

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by loboye0931 at 2010-07-14 10:51:51:
我以前也碰到过，结果发现是dNTP加错了，加成dATP了。你也检查一下试剂？还有

这个原因应该也不是，同样基因组用其他引物P过（有几对引物同时做的），也是这个酶和PCR体系，其他引物PCR结果正常，
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16楼2010-07-15 09:38:26
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wuwo

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by wywangying169 at 2010-07-14 15:45:28:
是不是空孔在照胶的时候反射而成啊，我也碰见过这种情况，有人曾这么给我解释

这个我网上搜索原因时也搜到过，确实有这种情况，不过这里不是，我直接加防护板肉眼看，就是这样，不是反光，而且Marker及未加样孔均正常，还是谢谢！
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17楼2010-07-15 09:42:10
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wuwo

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by ymzfeng at 2010-07-14 17:21:57:
优化下反应体系
你换的酶是什么酶
电泳时胶是否有污染或缓冲液是否有污染

谢谢！反应体系和条件我正在优化中，酶是takara的PrimerSTAR，能P长链的保真酶，这酶应该是可以，污染比较不会，这边buf等用的很快，经常换新，而且其他人前后跑的也都正常……无语了
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18楼2010-07-15 09:44:47
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wuwo

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by Aimey at 2010-07-15 08:15:49:
主要问题是样品不纯，样品中含糖类，蛋白类物质等，都会跑不出来。而且你的有明显拖尾，说明还有些降解了。重提吧

糖类可能有，但从基因组提取过程看应该极少，蛋白基本排除，测过纯度很高的。  拖尾确实……不过基因组为前一天新提……
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19楼2010-07-15 09:46:41
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wuwo

铜虫 (小有名气)
问题已解决，降低了一点退火温度，就ok了，回复里面比较有意义的我逐一赠金币，多谢大家出谋划策，谢谢！
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21楼2010-07-20 10:03:24
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