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xjx11228

木虫 (正式写手)

[交流] 如何求酶促反应中最大反应速度？单位是什么？

问题：对于一个酶促反应，通常由米氏方程求米氏常数和最大反应速度以及催化反转常数，可是有关数据只是底物一系列浓度及所对应的吸光度值，请问如何求出米氏常数？尤其是这个最大反应速度的单位不好确定？ 我是不是还缺少条件？文献都是10^-8 M s^-1,这个如何得出？谢谢各位了。

[ Last edited by xjx11228 on 2010-6-9 at 16:34 ]
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1楼2010-06-09 15:04:32
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xiangyu2888

金虫 (正式写手)
xjx11228(金币+3, 博学EPI+1): 2010-06-12 19:22:24
你的吸光度值【A】不能直接用作求算最大反应速度的参数，而是应该转换成产物浓度【Y】mol/L（这一步用标准曲线就可以得出），通过短时间t内的产物浓度的变化求出初反应速度r0,(mol/L.s)。假设你的底物浓度为【S】，则将底物浓度的倒数1/[S]作为横坐标，将反应初速度的倒数1/r0作为纵坐标作图，做出来的图上面就有最大反应速度和米氏常数这类的参数了，单位就是mol/(L.s)
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2楼2010-06-11 09:37:53
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xjx11228

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by xiangyu2888 at 2010-06-11 09:37:53:
你的吸光度值【A】不能直接用作求算最大反应速度的参数，而是应该转换成产物浓度【Y】mol/L（这一步用标准曲线就可以得出），通过短时间t内的产物浓度的变化求出初反应速度r0,(mol/L.s)。假设你的底物浓度为【S】 ...

非常谢谢你的回答。方法是对的。可是有一点还不明白。由A转换为浓度时由标准曲线来计算产物浓度。关键是这个产物浓度的标准曲线如何制得？还是用同一组数据?
如HRP对TMB底物的米氏常数和最大反应速度：
TMB浓度    Absorbance
1                       0.034
2                       .....
3                       .....
4
5
6
产物的浓度如何得到？测得A是底物氧化后产物的，是否由化学反应方程式得出。这样一来吸光度数值就没有用了。
是否有其它转换方法呢？用吸光度肯定不对，否则计算单位不对。
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3楼2010-06-12 19:20:41
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xjx11228

木虫 (正式写手)
求助中。。。。。。。。。
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4楼2010-06-13 09:55:07
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xiangyu2888

金虫 (正式写手)
所谓的标准曲线就是你的产物Y的浓度在你那台分光光度计上的吸光值A之间的对应关系，其实跟你的底物浓度没有关系。也就是你配置一定浓度的产物（这个需要用纯品，分析纯的即可），测定每个浓度下的吸光值，做一条直线，就是你的标准曲线，就是说产物浓度Y和吸光值A之间形成了一种关系：A=a+bY，这样你用你的底物反应完之后的反应液测得的吸光度，实际上对应着你的反应液里有多少产物，根据你标准曲线的方程计算就出来了，这样吸光值不就有用了吗。总结来说，标准曲线就是建立一个吸光值与产物浓度的关系，明白了吗？
这种标准曲线的做法是放之四海而皆准的，多看看书上的介绍你就可以发现，几乎所有的标准曲线都是建立一种目标产物浓度与检测值之间的关系，从而能根据实际样品的检测值来计算目标产物浓度，呵呵
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5楼2010-06-13 09:57:22
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xiangyu2888

金虫 (正式写手)
xjx11228(金币+3): 2010-06-13 12:38:19
补充一点，你只需要测定一条标准曲线（一系列浓度的产物浓度和吸光值的关系）A=a+bY
然后根据你举的例子中的吸光值计算出对应的一系列产物浓度，即可得到：
TMB浓度   产物浓度
1                   Y1
2                   Y2
……
如果你以TMB为底物的时间够短的话（设为t），则你需要求算米氏常数的反应初速度为Y/t,  单位mol/(L.s)，对应不同的底物浓度，就对应有一定的反应初速度，则：
TMB              R
1                  r1
2                  r2
……
再往下你就会了吧
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6楼2010-06-13 10:07:25
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xjx11228

木虫 (正式写手)
哦，我懂了，如果我没有底物氧化产物的纯品，就无法得出最大反应速度了。如TMB，还要求做联苯醌的标准曲线图，从而求对应的反应速度。可是这个联苯醌的纯品有没有卖的呢？
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7楼2010-06-13 12:37:47
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xiangyu2888

金虫 (正式写手)
xjx11228(金币+4): 2010-06-14 09:52:49
如果有名字的话，应该是有卖的，呵呵，你可以看看相关文献，祝你成功
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8楼2010-06-13 13:04:59
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xjx11228

木虫 (正式写手)
有文献中说用吸光度或荧光强度代替初始反应速度，但是求不出最大反应速度。
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9楼2010-06-13 16:18:28
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a且歌且行a

金虫 (小有名气)
不知楼主这个问题是怎么解决的，我现在也碰到没有纯品氧化产物的问题，想通过酶活来代替（酶活单位为umol/l/min)初速度，不知可行？
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助人自助，开心每一天。
10楼2012-05-13 19:01:59
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