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【求助/交流】大量金币感谢，基因克隆表达。 已有12人参与
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我想在E.coli中表达一个外源基因，并且要这个基因表达出来具有酶活性，能够转化底物，合成新的产物。但是有一点不明白的就是：在克隆外源基因的时候，从ATG开始，到TAA结束？还是从更上游的位置开始到更下游的位置结束？这两者之间有什么区别呢？ 第二个问题：如果在同一载体上克隆表达两个基因，这两个基因如何连接呢？是第一个基因的TAA直接续接第二个基因的ATG？还是中间需要添加一些片段？ 各位大侠啊：我是在读的硕士研究生，要开展分子生物学的课题。由于导师在这方面不太精通，因此求助一个问题。 [ Last edited by zhmy26 on 2010-5-12 at 08:28 ] |
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zhwenxing
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zhmy26(金币+4): 2010-05-11 15:19:36
scelab(金币+3):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-05-12 23:26:12
zhmy26(金币+4): 2010-05-11 15:19:36
scelab(金币+3):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-05-12 23:26:12
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1、原核表达的话，注意包涵体问题。那没活性。 2、真核表达，注意表达标签等共表达，导致多余，后期的切除也是麻烦。 3、你做的这个原核表达，若插入两个基因，可以用linker将其连接，有独立的，有分开的。一般是让两个基因处于不同的控制子之下。 4、共表达系统的质粒，转入基因时候，多考虑其表达蛋白的可溶性和表达丰度的一致性。 5、带有启动序列的质粒，可以直接用。自己添加强终止子也可以。 |
11楼2010-05-11 09:22:42
2楼2010-05-05 08:44:45
snoopyzxx
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zhmy26(金币+2): 2010-05-05 13:54:51
scelab(金币+4):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-05-05 15:33:31
zhmy26(金币+2): 2010-05-05 13:54:51
scelab(金币+4):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-05-05 15:33:31
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有很多载体可以选择，比如pet系列的。看你的要求，你可以使用非融合表达，即表达时不带标签，可以表达出天然的目的蛋白。一般表达载体都是载体具有启动子的，不需要自行添加，你只需将目的基因插入相应的酶切位点就可以了，至于终止，你可以使用载体上的终止子，你也可以在设计引物时自己加上双终止子TGATAA，我们一般都是自己加双终止子。表达的时候，载体是从启动子之后的第一个ATG开始表达，直到终止密码子。 第二个问题，现在有很多双表达系统可以选择，这种系统具有多个启动子，可以插入多个目的基因，这种系统表达出来的每个蛋白是独立分开的。而楼上介绍的SOE拼接表达出来的两个蛋白一般是连在一起的。 |
3楼2010-05-05 09:34:30
fungixx
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4楼2010-05-05 09:40:27
