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pidou213木虫 (正式写手)
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[交流]
【求助/交流】RACE 引物 已有4人参与
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请问做RACE的引物用什么纯化比较好？ HAP? PAGE?? 还是其他？？ 突然想到的，不知道怎么选择 |
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pidou213
木虫 (正式写手)
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为什么引物在某些时候需要纯化 DNA合成结束后，完整的DNA链在碱性溶液（如氢氧化铵）的作用下从固相支持物中解理下来。解离下来的溶液中既包含了完整的所需寡核苷酸，同时也包含了在合成过程中失败的DNA链（错误序列）。比如合成一个20个碱基寡核苷酸，其洗脱溶液中也包含了19，18，17个碱基等合成时错误的序列。错误序列的数量取决于合成效率。在许多实验如PCR中，这些错误的序列会与正确的全长产物竞争，因此在使用之前需要将其去除以提高下游应用的成功率。 不同应用对纯化方式的选择 应用领域 建议的纯化方式 AFLPTM 分析 脱盐引物在限制性片段扩增多态性研究（ARFP）中可被成功应用 反义研究 HPLC纯化的引物在相关文献中引用最多 循环测序 脱盐纯化的引物已经足够 文库构建中的第一链cDNA合成 用于文库构建中第一链合成的cDNA通常在其5’端有限制性内切酶克隆位点，因此最好用全长的，通过Cartridge、HPLC或PAGE纯化的引物 荧光测序 四种纯化级别的引物都可成功应用 凝胶迁移实验 建议使用Cartridge、HPLC和PAGE纯化的引物进行凝胶迁移率实验 GeneTrapper筛选 建议使用PAGE纯化引物。如果购买了脱盐引物，可以使用PAGE纯化说明书对其进行进一步纯化。在GeneTrapper系统中的加尾反应时，引物需要事先经过酚抽提和乙醇沉淀。 恒温测序 脱盐引物已经足够，Cartridge、HPLC和PAGE纯化引物也可以。 微阵列 标准脱盐引物已经足够 PCR 对于标准PCR，脱盐引物即可正常使用，其它三种纯度更高的方式也可以 5’端序列较为重要的PCR（例如限制性酶切位点，RNA聚合酶启动子） 为达到最高效率，Cartridge、，HPLC和PAGE纯化的引物是最好的选择。因为引物合成是从3’端到5’端，不完整的寡核苷酸的会从5’端缺失。在这些应用中使用5’端序列完整的全长序列是很重要的，否则缺失5’端部分序列的一组PCR产物将被合成 克隆接头产物 全长引物最适合有效的克隆，利用Cartridge、HPLC或PAGE纯化方式可得到合适的引物。对大于60个碱基的引物，PAGE纯化方式是最好的 位点特异性突变 一定要使用通过Cartridge、HPLC和PAGE纯化得到的全长引物，才可能得到最高比例的突变体克隆（尤其是预突变位点在5’端附近时）。采用脱盐引物也可以得到想要的突变。然而，一些野生型亲本载体有可能会覆盖掉这些突变。 |
3楼2010-04-29 18:49:25
695
木虫 (职业作家)
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2楼2010-04-29 18:38:40
cato8163
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4楼2010-04-29 21:42:15
5楼2010-04-30 09:15:35
