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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于简并性引物
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【有奖交流】积极回复本帖子，参与交流，就有机会分得作者 pidou213 的 3 个金币

pidou213

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】关于简并性引物 已有3人参与

用简并行引物扩出来一个片段，和预期的结果相似，然后连接T载体，转化进TOP10，蓝白斑筛选，培养，送到公司去测序，结果发现测出来的片段非常不好，和预期的片段碱基一点都不相同，请问这是怎么回事？

如果这个兼并性引物不行的话，那再设计简并行引物岂不是一样的结果啊？？


求助
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见得多爱的多
1楼 2010-04-16 10:31:50
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
pidou213(金币+1):期待你的再次回复 2010-04-16 11:41
首先请确定测序结果是否含有简并引物
设计简并引物，要注意简并度不能太高，另外要注意在引物的3‘端的五六个碱基，要尽可能的避免简并碱基，无法降低简并度的时候，可以考虑适当的使用次黄嘌呤H，因为他可以很好的和四种碱基配对。在PCR的时候要根据简并度，适当增加引物浓度。

每个引物都是不一样的，设计一个简并引物不好，不代表再设计还会不好，多设计几个，肯定会有好的。

祝楼主好运
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2楼2010-04-16 11:11:39
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pidou213

木虫 (正式写手)
★
amisking(金币+1):问得好。 2010-04-17 12:02
我只是觉得，简并行引物这一关，只要能够获得预期的片段，应该就没有什么问题吧？？

那也就是说，设计的简并行引物是合格的，可以扩增出片段，不会出现引物二聚体

这个是不是出现在测序部分的问题？
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-04-16 11:11:39:
首先请确定测序结果是否含有简并引物
设计简并引物，要注意简并度不能太高，另外要注意在引物的3‘端的五六个碱基，要尽可能的避免简并碱基，无法降低简并度的时候，可以考虑适当的使用次黄嘌呤H，因为他可以很好 ...

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3楼2010-04-16 11:41:10
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silicare

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★
1949stone(金币+1): 2010-04-16 18:36
简并引物嘛，当然错配的概率大大提升了
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4楼2010-04-16 11:43:13
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
amisking(金币+3):讨论的不错！ 2010-04-16 11:53
pidou213(金币+1):好的，谢谢，只是因为已经扩增出预期片段，测序后却发现不是目的片段，所以很不明白，呵呵 2010-04-16 12:11
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2010-04-16 11:41:10:
我只是觉得，简并行引物这一关，只要能够获得预期的片段，应该就没有什么问题吧？？

那也就是说，设计的简并行引物是合格的，可以扩增出片段，不会出现引物二聚体

这个是不是出现在测序部分的问题？



要知道你测序对不对，首先就要比对是否含有简并引物，比如只有载体，那么说明你没有插入目的片段，测的自然是不对，另外有的时候测序信号也会异常，要看一下测序的峰图，是不是可以准确判读等，如果是双向测的，可以比对一下是否一致，这些都可以判断测序的效果。

如果测序没有问题，那么就是引物存在问题，即使是和目的片段大小一致，也不能完全确定就是想要的片段，毕竟简并引物错配率还是提高很多，还是要以测序结果为准，有的时候真正的目的片段和预期的大小也有差异，所以接近大小的片段建议都回收一下
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5楼2010-04-16 11:52:23
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pidou213

木虫 (正式写手)
不过测序公司说：他们测的时候觉得菌液浓度低，质粒量比较少，所以打算重新测呢？/

这能说明什么问题么？？
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-04-16 11:52:23:

要知道你测序对不对，首先就要比对是否含有简并引物，比如只有载体，那么说明你没有插入目的片段，测的自然是不对，另外有的时候测序信号也会异常，要看一下测序的峰图，是不是可以准确判读等，如果是双向测的， ...

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见得多爱的多
6楼2010-04-16 12:12:32
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2010-04-16 12:12:32:
不过测序公司说：他们测的时候觉得菌液浓度低，质粒量比较少，所以打算重新测呢？/

这能说明什么问题么？？




说明你放大的时间太短，或者菌液不够新鲜吧，可能会影响测序结果，重新放大一下吧
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7楼2010-04-16 22:23:27
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