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pidou213

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】关于简并性引物已有3人参与

用简并行引物扩出来一个片段,和预期的结果相似,然后连接T载体,转化进TOP10,蓝白斑筛选,培养,送到公司去测序,结果发现测出来的片段非常不好,和预期的片段碱基一点都不相同,请问这是怎么回事?

如果这个兼并性引物不行的话,那再设计简并行引物岂不是一样的结果啊??


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pidou213

木虫 (正式写手)

不过测序公司说:他们测的时候觉得菌液浓度低,质粒量比较少,所以打算重新测呢?/

这能说明什么问题么??
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-04-16 11:52:23:

要知道你测序对不对,首先就要比对是否含有简并引物,比如只有载体,那么说明你没有插入目的片段,测的自然是不对,另外有的时候测序信号也会异常,要看一下测序的峰图,是不是可以准确判读等,如果是双向测的, ...

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6楼2010-04-16 12:12:32
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

pidou213(金币+1):期待你的再次回复 2010-04-16 11:41
首先请确定测序结果是否含有简并引物
设计简并引物,要注意简并度不能太高,另外要注意在引物的3‘端的五六个碱基,要尽可能的避免简并碱基,无法降低简并度的时候,可以考虑适当的使用次黄嘌呤H,因为他可以很好的和四种碱基配对。在PCR的时候要根据简并度,适当增加引物浓度。

每个引物都是不一样的,设计一个简并引物不好,不代表再设计还会不好,多设计几个,肯定会有好的。

祝楼主好运
2楼2010-04-16 11:11:39
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pidou213

木虫 (正式写手)


amisking(金币+1):问得好。 2010-04-17 12:02
我只是觉得,简并行引物这一关,只要能够获得预期的片段,应该就没有什么问题吧??

那也就是说,设计的简并行引物是合格的,可以扩增出片段,不会出现引物二聚体

这个是不是出现在测序部分的问题?
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-04-16 11:11:39:
首先请确定测序结果是否含有简并引物
设计简并引物,要注意简并度不能太高,另外要注意在引物的3‘端的五六个碱基,要尽可能的避免简并碱基,无法降低简并度的时候,可以考虑适当的使用次黄嘌呤H,因为他可以很好 ...

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3楼2010-04-16 11:41:10
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silicare

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1949stone(金币+1): 2010-04-16 18:36
简并引物嘛,当然错配的概率大大提升了
4楼2010-04-16 11:43:13
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