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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】酶切失败分析
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xiaomu3811

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】酶切失败分析 已有9人参与

用BstXI（最适温度45）和EcoRI（最适温度37）双酶切pFL61载体,结果切不动，麻烦帮忙分析一下原因。

BstXI：1

EcoRI：1

10*Hbuffer：2

质粒：5

水：11

总体系：20

酶切条件：先在37°酶切3小时，再于45°酶切3小时。
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1楼 2010-04-08 22:55:03
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DNAhelix

银虫 (著名写手)
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scelab(金币+1):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-04-08 23:37
是切空载？
看到右边两条亮带的带型，感觉被切了。
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智慧活法：不生气，不计较！
2楼2010-04-08 23:08:06
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1110rainjob

铜虫 (小有名气)
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scelab(金币+2):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-04-08 23:37
H buffer是这两个酶双酶切时的公用buffer么？
你能否把你电泳图上的样品各是什么样品标示一下？
如果最左边的第一个是未切前的载体，后几个是切后的样品，那么从分子量之间的差异，感觉你的载体已经切开了。你要切下多大的片段啊？
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3楼2010-04-08 23:13:11
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
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1949stone(金币+2): 2010-04-09 10:32
表达不完全，切开了能切下多大的片段啊？
建议首先加EcoRI，37℃反应俩个小时后，补加BstXI然后45℃反应两个小时；
要是效果还是不好的话，只能是单酶切回收后再用另一种酶
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2010-04-09 08:52:36
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快乐由自己go

银虫 (小有名气)
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1949stone(金币+2): 2010-04-09 10:32
把各个泳道的样品标明一下吧。如果图片可以旋转180度，会更方便看些。关注中……
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5楼2010-04-09 09:04:58
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gaozx123

金虫 (小有名气)
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1949stone(金币+1): 2010-04-09 10:32
为什么不一个个酶切呢，一般先进行低温度的酶切，再进行高温度的酶切，还有就是要注意所用酶的缓冲液。
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6楼2010-04-09 09:14:32
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xiaomu3811

金虫 (小有名气)
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1949stone(金币+1):欢迎发图 2010-04-09 10:33
scelab(金币+5):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-04-09 12:42
引用回帖:
Originally posted by DNAhelix at 2010-04-08 23:08:06:
是切空载？
看到右边两条亮带的带型，感觉被切了。

理论上切开了的话，应该切出两条带，一条越为850bp,另一条约为4500bp,我把我的载体图和酶切后电泳图重新上传，希望大家帮忙分析分析。电泳图上两边为marker，中间是酶切的同一质粒。
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7楼2010-04-09 09:38:24
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lyg7720349

铜虫 (小有名气)
是不是温度没掌握好
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望大家都各有所获！
8楼2010-04-09 12:59:57
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crab1983

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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scelab(金币+3):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-10 11:48
我觉得你这个两个酶不能同时切 你这个酶是哪个公司的 你可以打电话给他们公司的技术部  问问这两个酶怎么切  我觉得你应该切完一个沉淀回收 然后再切下一个  你最好是打电话问问 我曾经也是双酶切 两个酶不能同时切 我打电话问了宝生物的技术部 他们就解答我了 我用的酶是宝生物的
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9楼2010-04-09 15:21:48
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琴瑟不鸣

铁虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你的buffer 用的对不对啊？一般里面有两种buffer 的，，，一种是用单酶切的，，一种是双酶切的，，，要是双酶切的话，，你最好去试剂公司的网站看看，，，选个合适的啊，，，
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老虎
10楼2010-04-12 16:44:20
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