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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】紧急求助!关于细菌总DNA提取与16SRDNA的PCR问题!
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wwsw38

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】紧急求助!关于细菌总DNA提取与16SRDNA的PCR问题! 已有6人参与

我做的是从未知细菌提取总DNA,然后16SRDNA的PCR鉴定.遇到如下问题:

问题一:在提取DNA的时候是先收集4ml菌液,用10μl 10mg/ml的溶菌酶+0.5 ml溶液A(10g/L无水葡萄糖 25mmol/L Tris-HCl 10mmol/L  EDTA)悬浮细胞,然后加20μl蛋白酶K(20 mg/ml)轻柔混匀,就现此时溶液变成十分粘稠的胶状物,以至于后面的酚抽提的时候上清液也十分粘稠,几乎吸不出上清,甚至后面提出的DNA也是粘稠状的,电泳出来DNA扩散很大.不知道为什么会出现粘稠???

问题二:上面总共有是个不同的样品,总DNA电泳出来看起来都差不多,但是P了许多次,只有其中一个样能P出来,不知道怎么回事?
         
高手们,请帮帮小弟啊,初来些论坛,没有金币........


补充:今天我又提了一次,发现不是加了蛋白酶K的时候出现的粘稠,而是之后加了25μl的10%SDS之后马上就出现了粘稠,之后的所的步骤都有粘稠.后面提出来的DNA里都有粘稠物,并且电泳出来的DNA条带很弱.4个样品里只有一个样能很清楚的看到DNA带.....我没提出来DNA的菌是一种涂料里的污染菌,提出DNA的菌是红茶菌里的一种阳性细菌,不知道这和菌的种类是不是有关系?

[ Last edited by wwsw38 on 2010-4-6 at 21:04 ]
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为自己加油
1楼 2010-04-05 23:47:23
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
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1949stone(金币+1): 2010-04-06 09:21
P不出来可能还是跟你的DNA质量有关，16s很好做的，很多人都是污染严重，P不出来很少见
至于粘稠，我们没有碰到你说的情况，不知道为什么了
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2楼2010-04-05 23:57:07
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wwsw38

铁虫 (小有名气)
你说的污染严重是指模板里有影响PCR的杂质吗?
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为自己加油
3楼2010-04-06 00:01:04
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charon1982

铁杆木虫 (著名写手)
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1949stone(金币+2):完全同意 2010-04-06 09:21
可能是胞外多糖，试试加CTAB, 降低退火温度扩
还有你的是不是细菌啊，若是酵母怎么也扩不出来的
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帮助虫友，提升自己
4楼2010-04-06 02:03:53
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51chuguo

木虫 (正式写手)
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1949stone(金币+3): 2010-04-06 09:21
引用回帖:
Originally posted by wwsw38 at 2010-04-05 23:47:23:
我做的是从未知细菌提取总DNA,然后16SRDNA的PCR鉴定.遇到如下问题:

问题一:在提取DNA的时候是先收集4ml菌液,用10μl 10mg/ml的溶菌酶+0.5 ml溶液A(10g/L无水葡萄糖 25mmol/L Tris-HCl 10mmol/L  EDTA)悬浮细胞 ...

我们做根瘤菌的，提DNA的方法如下，该法用于提取其它细菌的DNA也可以，供参考：
将菌株接种于5ml液体酵母粉－甘露醇培养基(YMA)（你可用你自己的培养基）中，28℃摇床振荡培养3-4天。13000r/min，离心3min收集菌体。加入800μL GUTC缓冲液，然后加入60μL硅藻土悬浮液(悬浮于等体积的TE 缓冲液中)，充分混合后，室温下放置60min，以破碎细菌细胞壁；13000r/min，瞬时离心，弃去上清液；重新用500μL GUTC缓冲液悬浮，并于室温下放置15min；13000r/min，离心3min，弃去上清液；用600μL洗涤缓冲液离心洗涤2次；再用600μL 75％乙醇离心洗涤1次；真空干燥沉淀物，直至硅藻土变白；重新悬浮于100μL无菌双蒸水中，55～65℃保温10min，以促进DNA的溶解；然后离心收集上清液，即为DNA溶液。在含有EB的0.8%琼脂糖凝胶上，100V电泳1h，UV下检测DNA的浓度。DNA溶液于-20℃保存。

另外不想提DNA的话，可用灭菌的牙签挑少许菌落代替DNA模板，直接加入到PCR反应混合物，在PCR仪上变性10分钟，再加入Taq酶，按正常的扩增程序去扩增16S，应该很容易。
祝成功！

[ Last edited by 51chuguo on 2010-4-6 at 02:40 ]
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5楼2010-04-06 02:39:25
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dyszz

铜虫 (小有名气)
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1949stone(金币+1): 2010-04-06 09:21
应该是细胞裂解产生的一系列如多糖，蛋白之类的东西，导致粘稠。我遇见过，就是在质粒提取后跑胶时候遇见……反正重新做了……
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6楼2010-04-06 08:47:51
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特洛伊

金虫 (小有名气)
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1949stone(金币+1): 2010-04-06 09:21
粘稠物质有可能是多糖、蛋白等物质。
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成本
7楼2010-04-06 09:00:40
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wwsw38

铁虫 (小有名气)
★
1949stone(金币+1): 2010-04-06 09:21
菌落PCR我也做了的,我先是把未知的菌沸水浴30分钟然后直接作为模板进行16SRDNA的PCR,结果完全没有条带,有没有人知道怎么回事,这样做有可能成功吗?
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为自己加油
8楼2010-04-06 09:16:03
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wwsw38

铁虫 (小有名气)
如果是多糖的话有没有什么好方法可以去除这些多糖呢?我提了三次都有这些粘稠物,我怀疑是这些东西导致我的DNA不纯以致于后面P不出来.
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为自己加油
9楼2010-04-06 09:17:39
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
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引用回帖:
Originally posted by wwsw38 at 2010-04-06 00:01:04:
你说的污染严重是指模板里有影响PCR的杂质吗?

我说的污染，是空白出带啊，就是不加模板也能P出来
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10楼2010-04-06 09:32:32
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