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【求助/交流】紧急求助!关于细菌总DNA提取与16SRDNA的PCR问题!已有6人参与
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我做的是从未知细菌提取总DNA,然后16SRDNA的PCR鉴定.遇到如下问题: 问题一:在提取DNA的时候是先收集4ml菌液,用10μl 10mg/ml的溶菌酶+0.5 ml溶液A(10g/L无水葡萄糖 25mmol/L Tris-HCl 10mmol/L EDTA)悬浮细胞,然后加20μl蛋白酶K(20 mg/ml)轻柔混匀,就现此时溶液变成十分粘稠的胶状物,以至于后面的酚抽提的时候上清液也十分粘稠,几乎吸不出上清,甚至后面提出的DNA也是粘稠状的,电泳出来DNA扩散很大.不知道为什么会出现粘稠??? 问题二:上面总共有是个不同的样品,总DNA电泳出来看起来都差不多,但是P了许多次,只有其中一个样能P出来,不知道怎么回事? 高手们,请帮帮小弟啊,初来些论坛,没有金币........ 补充:今天我又提了一次,发现不是加了蛋白酶K的时候出现的粘稠,而是之后加了25μl的10%SDS之后马上就出现了粘稠,之后的所的步骤都有粘稠.后面提出来的DNA里都有粘稠物,并且电泳出来的DNA条带很弱.4个样品里只有一个样能很清楚的看到DNA带.....我没提出来DNA的菌是一种涂料里的污染菌,提出DNA的菌是红茶菌里的一种阳性细菌,不知道这和菌的种类是不是有关系? [ Last edited by wwsw38 on 2010-4-6 at 21:04 ] |
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我们做根瘤菌的，提DNA的方法如下，该法用于提取其它细菌的DNA也可以，供参考： 将菌株接种于5ml液体酵母粉－甘露醇培养基(YMA)（你可用你自己的培养基）中，28℃摇床振荡培养3-4天。13000r/min，离心3min收集菌体。加入800μL GUTC缓冲液，然后加入60μL硅藻土悬浮液(悬浮于等体积的TE 缓冲液中)，充分混合后，室温下放置60min，以破碎细菌细胞壁；13000r/min，瞬时离心，弃去上清液；重新用500μL GUTC缓冲液悬浮，并于室温下放置15min；13000r/min，离心3min，弃去上清液；用600μL洗涤缓冲液离心洗涤2次；再用600μL 75％乙醇离心洗涤1次；真空干燥沉淀物，直至硅藻土变白；重新悬浮于100μL无菌双蒸水中，55～65℃保温10min，以促进DNA的溶解；然后离心收集上清液，即为DNA溶液。在含有EB的0.8%琼脂糖凝胶上，100V电泳1h，UV下检测DNA的浓度。DNA溶液于-20℃保存。 另外不想提DNA的话，可用灭菌的牙签挑少许菌落代替DNA模板，直接加入到PCR反应混合物，在PCR仪上变性10分钟，再加入Taq酶，按正常的扩增程序去扩增16S，应该很容易。 祝成功！ [ Last edited by 51chuguo on 2010-4-6 at 02:40 ] |
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