| 查看: 1412 | 回复: 11 | |||
| 当前主题已经存档。 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[交流]
【求助/交流】紧急求助!关于细菌总DNA提取与16SRDNA的PCR问题! 已有6人参与
|
|||
|
我做的是从未知细菌提取总DNA,然后16SRDNA的PCR鉴定.遇到如下问题: 问题一:在提取DNA的时候是先收集4ml菌液,用10μl 10mg/ml的溶菌酶+0.5 ml溶液A(10g/L无水葡萄糖 25mmol/L Tris-HCl 10mmol/L EDTA)悬浮细胞,然后加20μl蛋白酶K(20 mg/ml)轻柔混匀,就现此时溶液变成十分粘稠的胶状物,以至于后面的酚抽提的时候上清液也十分粘稠,几乎吸不出上清,甚至后面提出的DNA也是粘稠状的,电泳出来DNA扩散很大.不知道为什么会出现粘稠??? 问题二:上面总共有是个不同的样品,总DNA电泳出来看起来都差不多,但是P了许多次,只有其中一个样能P出来,不知道怎么回事? 高手们,请帮帮小弟啊,初来些论坛,没有金币........ 补充:今天我又提了一次,发现不是加了蛋白酶K的时候出现的粘稠,而是之后加了25μl的10%SDS之后马上就出现了粘稠,之后的所的步骤都有粘稠.后面提出来的DNA里都有粘稠物,并且电泳出来的DNA条带很弱.4个样品里只有一个样能很清楚的看到DNA带.....我没提出来DNA的菌是一种涂料里的污染菌,提出DNA的菌是红茶菌里的一种阳性细菌,不知道这和菌的种类是不是有关系? [ Last edited by wwsw38 on 2010-4-6 at 21:04 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
筑牢营养安全线：以精准检测，护健康基石
已经有0人回复
-
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有211人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
3楼2010-04-06 00:01:04
yujiaping1
木虫 (著名写手)
- MolEPI: 3
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 1365.2
- 散金: 10
- 红花: 5
- 帖子: 1174
- 在线: 66.6小时
- 虫号: 929883
- 注册: 2009-12-17
- 性别: MM
- 专业: 疫苗学
2楼2010-04-05 23:57:07
charon1982
铁杆木虫 (著名写手)
- 应助: 58 (初中生)
- 金币: 5106.2
- 散金: 350
- 红花: 12
- 帖子: 1250
- 在线: 469.8小时
- 虫号: 224872
- 注册: 2006-03-22
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
4楼2010-04-06 02:03:53
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+3): 2010-04-06 09:21
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+3): 2010-04-06 09:21
|
我们做根瘤菌的，提DNA的方法如下，该法用于提取其它细菌的DNA也可以，供参考： 将菌株接种于5ml液体酵母粉－甘露醇培养基(YMA)（你可用你自己的培养基）中，28℃摇床振荡培养3-4天。13000r/min，离心3min收集菌体。加入800μL GUTC缓冲液，然后加入60μL硅藻土悬浮液(悬浮于等体积的TE 缓冲液中)，充分混合后，室温下放置60min，以破碎细菌细胞壁；13000r/min，瞬时离心，弃去上清液；重新用500μL GUTC缓冲液悬浮，并于室温下放置15min；13000r/min，离心3min，弃去上清液；用600μL洗涤缓冲液离心洗涤2次；再用600μL 75％乙醇离心洗涤1次；真空干燥沉淀物，直至硅藻土变白；重新悬浮于100μL无菌双蒸水中，55～65℃保温10min，以促进DNA的溶解；然后离心收集上清液，即为DNA溶液。在含有EB的0.8%琼脂糖凝胶上，100V电泳1h，UV下检测DNA的浓度。DNA溶液于-20℃保存。 另外不想提DNA的话，可用灭菌的牙签挑少许菌落代替DNA模板，直接加入到PCR反应混合物，在PCR仪上变性10分钟，再加入Taq酶，按正常的扩增程序去扩增16S，应该很容易。 祝成功！ [ Last edited by 51chuguo on 2010-4-6 at 02:40 ] |
5楼2010-04-06 02:39:25
