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bihaiqingt

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】有关his纯化的问题 已有5人参与

最近做蛋白纯化,用Ni-NTA Agarose过柱,wash buffer:10mM咪唑磷酸缓冲液(PH=8.0);elution buffer:500mM咪唑磷酸缓冲液(PH=8.0)。做过几次,一直洗不下来;后来降低PH,还是不行。从蛋白结构看不出his是否折叠在内部,过柱前经活性检测,蛋白已经表达·····
       实在找不出哪地方出了纰漏,请教高手指点·····

[ Last edited by bihaiqingt on 2010-4-5 at 21:09 ]
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DNAhelix

银虫 (著名写手)

确定有His融合蛋白挂在柱子上?
智慧活法:不生气,不计较!
2楼2010-04-05 22:29:40
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)


scelab:欢迎常来交流~~~:tiger06: 2010-04-06 16:06
scelab(金币+1): 2010-04-06 16:06
bihaiqingt(金币+2):有道理,谢谢 2010-04-06 16:23
你的量大吗?
也不一定是没有洗下来吧。
0.5M咪唑已经足够将两个HIS标签洗脱下来了。
如果是折叠在蛋白内部,应该是挂不上才对,你可以测一下穿透液。
你用测活的方法检测我估计有问题,有可能纯化前有活性,洗脱下来失活了呢?建议跑个PAGE电泳看看。
VX:19192310212;公众号:生物技术与IVD
3楼2010-04-05 23:17:44
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主

先确定你的蛋白是否已经挂上
4楼2010-04-06 09:55:50
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mql1986

木虫 (小有名气)

同意三楼。。。
因为我上周刚刚做过His蛋白纯化。。。
5楼2010-04-06 14:00:01
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bihaiqingt

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by DNAhelix at 2010-04-05 22:29:40:
确定有His融合蛋白挂在柱子上?

确定
6楼2010-04-06 16:21:45
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