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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】提取瘤胃宏基因组DNA，如何避免提到植物的DNA
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【有奖交流】积极回复本帖子，参与交流，就有机会分得作者 段家一凡 的 9 个金币
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段家一凡

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】提取瘤胃宏基因组DNA，如何避免提到植物的DNA已有1人参与

如题，我想用直接提取法提取瘤胃未培养微生物的宏基因组DNA，用于测序，那么常规提取的话，应该会混有很多植物的DNA，这样宏基因组测序的会测到很多植物的基因组DNA，造成不必要的浪费和测序结果分析的困难。间接提取法（先分离细胞）也是不行的，因为瘤胃纤维素降解微生物应该和植物细胞壁紧密结合，请问怎么可以选择性的提取到微生物的DNA。
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1楼2010-03-15 21:25:36
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段家一凡

木虫 (正式写手)
顶一下，请提供一个思路
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2楼2010-03-15 21:43:18
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段家一凡

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-03-15 22:27:09:
你想测序什么，测序微生物的某个基因，还是整个基因组？
我认为你没有必要在乎植物DNA污染微生物基因组，不论你的目的是什么，之后你都要使用特异的引物钓到你要测序的微生物片段，也就是说你使用的引物是对微生 ...

谢谢。我的是宏基因组测序，宏基因组我解释一下，是一个环境样品所有微生物的的基因组，是一个混合基因组，比如土壤，可能有上1000中细菌和真菌，我的目的就是要吧这一千种微生物的基因组全部的序列都拿到手，当然是理论上的。我现在讲的瘤胃是牛的降解植物性食物的地方，植物性食物是共生其中的微生物降解的，微生物是结合在植物细胞壁的，不是一种菌，可能也是上1000种菌，我的目的是对微生物的基因组测序，而不想测到植物的基因组序列，一般的宏基因组提取方法都不可避免提到植物的DNA，如果提到的植物的DNA多的话，那么最终很大部分的测序就是做的无用功，比如我测得100G的序列，其中植物的占了一半，那不是亏大了。不知我解释清楚没有。我不是测一个基因组，也不是克隆某个基因，使用高通量测序技术如solexa和454对整个的微生物系统做研究。问题的关键是植物和微生物混在一起，有没有只是把微生物的细胞破裂，而植物的细胞没有破裂的一种方法？
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4楼2010-03-16 00:36:08
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段家一凡

木虫 (正式写手)
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Originally posted by silicare at 2010-03-16 09:11:46:
当你彻底了解了solexa原理就ok了

[ Last edited by silicare on 2010-3-16 at 09:13 ]

原理我就不用去了解了，这是测序的事情，不就是将基因组打成小片段，大规模测序，拼接。我的问题不是测序的问题，而是DNA提取的问题，微生物和植物混杂在一起，怎么特异的提到微生物的DNA？如果不了解宏基因组，可能也不会理解我的问题，悲惨啊。
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6楼2010-03-16 09:51:24
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段家一凡

木虫 (正式写手)
有没有做宏基因组测序的虫子，请给点意见。
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7楼2010-03-16 11:28:29
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段家一凡

木虫 (正式写手)
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Originally posted by yujiaping1 at 2010-03-16 11:44:31:
是你没有搞清楚原理，所以才这样问的，你说的宏基因组我明白，但是你想测序菌的时候，必须要对细菌基因进行PCR，肯定有这样一个步骤，植物DNA还是不会干扰你的微生物基因组。再者，如何测序你不需要搞清楚，但是测 ...

我不是克隆或测序某一个微生物的某一个特别的基因，所以应该不用特异的PCR，也就没有你所说的该步骤了。基因组测序也不需要设计特别的引物的，都是用通用引物来测，这点我也是知道的。宏基因组是对未培养微生物的研究，绝大部分的环境微生物的序列是未知的，请问用什么序列来设计引物PCR？其实我的问题与测序真的没有多大的关系，只是测序前样品的准备，我只需要微生物的DNA，而不需要植物的DNA，怎么区分。基因组测序可不管是微生物的还是植物的DNA，只要是DNA都一样可以测出来的，不会涉及到特异PCR的步骤的，现在不知说请楚没有。
我的问题有没有只针对于微生物破壁的方法，而不是吧植物细胞也破了？
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9楼2010-03-16 14:42:57
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段家一凡

木虫 (正式写手)
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Originally posted by yixuanwin at 2010-03-16 15:16:14:
通用引物也不是微生物 植物都通用啊。。。 微生物总有测出来过的。 设计应该也不难吧。

怎么都回答测序的问题呢，测序还不是我关心的主要问题。这问题回答的偏离目标了，但也非常感谢参与。基因组测序没有谁设计引物来测序的，除非是后面来验证基因组序列拼接的对不对，才会设计特异引物来PCR扩增看实际的片段大小与拼接的大小是否相符。另外通用引物是载体的序列，与外援DNA的来源是没有相关的，不然基因组怎么测序啊，微生物和植物测序的策略都是一样的，只是测序的量的多少。我感觉你还没理解我的问题。请再给我想想办法。
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11楼2010-03-16 17:43:14
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段家一凡

木虫 (正式写手)
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12楼2010-03-17 11:57:01
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段家一凡

木虫 (正式写手)
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Originally posted by yujiaping1 at 2010-03-17 12:17:09:

照你这么说植物基因组测出来之后岂不是不一定能分辨出来吗？我觉得好像还是不对，据我所知，是用特殊的方法获得细菌的基因组后测序的

[ Last edited by yujiaping1 on 2010-3-17 at 12:20 ]

对了，我就是想知道用什么特殊的方法宏环境样品中获得细菌的基因组。如果植物和微生物的基因组同时测，植物的基因组可以分辨的出来，通过Blast就可以了，但最好是已测过的基因组，如水稻，但这样太浪费了，假设我测了10G的宏基因组序列，有一半是我不需要的植物DNA序列，那不可亏大了，另外基因注释也很麻烦了。你可以想象一下，如果你测某一个具体的微生物的基因组，你的DNA样品被污染了，混有了其他的微生物的DNA，而且比较多，那么你测出来的结果就完蛋了。
我查了也没有什么特殊的办法只是选择性的裂解微生物的细胞，不知你能否提供一下信息的来源，先谢谢了。
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14楼2010-03-17 12:49:02
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段家一凡

木虫 (正式写手)
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Originally posted by lcat at 2010-03-18 18:06:07:
好多朋友的回答答非所问啊，可能或是不了解宏基因组测序的目的，以为只是想钓某个基因啊、鉴定菌种组成啊什么的，或是不了解DNA测序只认序列不区分物种的特点，我自己的看法是：
1. 虽然没做过实验，我倒觉得基因 ...

终于遇到了小同行了。据我所知华大在测熊猫的肠道微生物的时候，确实测到了很多竹的基因组DNA，而且量还是很多的，这是一种浪费，而且对后期的宏基因组的基因的注释也是很麻烦的。所以你提到的建议先测一点看看，倒也是比较好的方法。另华大刚报道了人的肠道的宏基因组的测序，达到500G，量应该是所有报导里面最大的了，但是好像没有公布提取的方法，提取的方法引用的一篇文献，该文献也没有介绍方法，基因组的提取只是一句带过，真奇怪，然道该方法需要保密，不介绍方法，这文章怎么可以也能发出来呢，可能他们已经解决了如何去掉或防止污染的植物DNA的方法，不知有谁知道他们所用的详细的方法。
关于瘤胃微生物，针对于植物细胞壁的降解来说的，一般认为与食物紧密结合的微生物才是重要的部分，瘤胃液部分倒不是很重要，所以要解决的问题还是如何从混合物中特异提取微生物的DNA问题。关于你说的纤维素酶的处理，可能也是一个思路，但植物细胞壁含有很多的其他多糖，可能还需添加其他的糖基水解酶类才行，可以尝试。
关于宏cDNA的测序，那可能是下一步的打算，毕竟细菌还是在瘤胃纤维素的降解起主导作用，宏cDNA侧重点还是真菌的方面。非常感谢提到建议，请继续探讨。
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18楼2010-03-19 00:43:16
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