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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】taq酶P出来了，pfu却怎么也出不来？
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陈思容

铜虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】taq酶P出来了，pfu却怎么也出不来？

如题，最近在P的一个基因，用taq酶出来清晰的条带，但是用pfu酶怎么也出不来，跑胶一片空白，两种酶P的反应体系一样，反应条件，taq为1min,pfu的延伸时间为2min,但就是没有条带，真让人崩溃！各位高手，看看可能是什么原因，先谢了
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1楼 2010-03-05 18:28:09
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yang0071

木虫 (职业作家)
★ ★ ★
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amisking(金币+2): 2010-03-05 19:35
pfu酶本身对模板 引物 镁离子浓度的要求就比taq高
p不出来很正常的
改变镁离子浓度或者降低退火温度
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2楼2010-03-05 18:36:41
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Charlie1331

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
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amisking(金币+2): 2010-03-05 19:36
pfu由于是高保真酶，出错率比taq酶低很多，代价就是对条件的要求苛刻，而且不容易P，但是P出来的基本上都不会出错。推荐Takara公司的PrimerStar 蛮不错。
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3楼2010-03-05 18:52:02
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陈思容

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by yang0071 at 2010-03-05 18:36:41:
pfu酶本身对模板 引物 镁离子浓度的要求就比taq高
p不出来很正常的
改变镁离子浓度或者降低退火温度

请问为什么要降低退火温度，改变退火时间有影响吗
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4楼2010-03-08 09:29:47
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heismeng

金虫 (小有名气)
★
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annealing时间是由酶决定的 温度是由引物决定的
你既然拿Taq做出来了 就往下做呗 如果不是特别长总能挑出没有变异的吧 pfu确实不好做 我们只在用plasmid当模板的时候才用
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5楼2010-03-08 09:59:05
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老虎情人

新虫 (初入文坛)
★
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推荐使用GC buffer 1或者2，因为我和你遇到一样的问题，你可以去那个Takara公司去定，pfu高保真本来要求就高，还看你基因里面GC含量的
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6楼2010-03-08 13:22:07
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zhyzx

金虫 (小有名气)
★
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这种情况很常见，所以通常我都会先用普通的taq酶做，除非要求比较高才会用pfu
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7楼2010-03-08 13:32:58
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★
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最后的72度延长时间设置成你Taq酶P的时候的两倍，Pfu扩增能力没有Taq那么强。

要是改变了还不行的话就试试Takara的 EXtaq吧。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
8楼2010-03-08 14:43:44
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yang0071

木虫 (职业作家)
★
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引用回帖:
Originally posted by 陈思容 at 2010-03-08 10:29:47:

请问为什么要降低退火温度，改变退火时间有影响吗

降低退火温度，可以让引物更好的结合到模板上面，但是非特异性条带会增加
延长退火时间也可以起到让引物更好的结合到模板上面类似的作用，但是效果没有前者好
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9楼2010-03-08 15:48:17
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陈思容

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-03-08 14:43:44:
最后的72度延长时间设置成你Taq酶P的时候的两倍，Pfu扩增能力没有Taq那么强。

要是改变了还不行的话就试试Takara的 EXtaq吧。

时间是2min的，用taq是1min，前端有弥散的带，就是没有主带
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10楼2010-03-09 09:38:16
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