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zjwang

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】western blot

最近做western blot的时候出现一点问题:我用的是GST标签,诱导蛋白走sds-page能看到诱导后出现一条新的带,但是western检测没有,而作为对照的空载体有GST条带。不知道怎么回事,大家有没有遇到过,求指点!谢过!
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qrf0704

铁虫 (小有名气)

zjwang(金币+1): 2010-01-28 17:41
对于Wester做的不多,没出现过你这种情况,应该是你诱导表达的蛋白没有活性吧?
2楼2010-01-28 16:24:14
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yang0071

木虫 (职业作家)

zjwang(金币+1): 2010-01-28 17:41
使用的检测抗体是啥?目的蛋白分子量多少?大分子的话,可能空间构象上覆盖GST的抗体识别区域。建议使用目的蛋白的特异抗体
3楼2010-01-28 16:31:26
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zjwang

木虫 (正式写手)

用gst抗体检测的,目的蛋白大约77k,加上gst差不多103k。像你说的空间构象覆盖gst抗体识别区几率有多大?没有目的蛋白的特异抗体。这个蛋白诱导后想过柱子纯化,这样western检测不出来不知道能不能过柱子。
4楼2010-01-28 17:11:51
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sutao1979

木虫 (著名写手)

小木虫10年groupleader

zjwang(金币+1): 2010-01-28 17:40
平行做,诱导的和没诱导的loading到gel上,明确是否真的诱导出来了,如果没问题,western blot没有带,说明蛋白没活性
会当凌绝顶,一览众山小
5楼2010-01-28 17:34:05
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zjwang

木虫 (正式写手)

没有活性western检测不出来?你的意思是蛋白没有形成正确的高级结构?
6楼2010-01-28 17:40:28
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zjwang

木虫 (正式写手)

有没有解决的办法?
7楼2010-01-28 17:41:07
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sutao1979

木虫 (著名写手)

小木虫10年groupleader

问一句你的蛋白是在上清还是包涵体里?
会当凌绝顶,一览众山小
8楼2010-01-28 17:45:06
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towindflower

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by zjwang at 2010-01-28 15:00:29:
最近做western blot的时候出现一点问题:我用的是GST标签,诱导蛋白走sds-page能看到诱导后出现一条新的带,但是western检测没有,而作为对照的空载体有GST条带。不知道怎么回事,大家有没有遇到过,求指点!谢过!

看你用的什么抗体了,而且肉眼都能看到的条带还需要做western?
如果用的抗体正确那就可能有两个原因:1.western 不过关,2.蛋白表达错了
9楼2010-01-28 17:51:53
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zjwang

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by sutao1979 at 2010-01-28 17:45:06:
问一句你的蛋白是在上清还是包涵体里?

不知道,用全菌体蛋白走的电泳
10楼2010-01-28 18:01:43
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