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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】western blot
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zjwang

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】western blot

最近做western blot的时候出现一点问题：我用的是GST标签，诱导蛋白走sds-page能看到诱导后出现一条新的带，但是western检测没有，而作为对照的空载体有GST条带。不知道怎么回事，大家有没有遇到过，求指点！谢过！
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1楼 2010-01-28 15:00:29
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qrf0704

铁虫 (小有名气)
zjwang(金币+1): 2010-01-28 17:41
对于Wester做的不多，没出现过你这种情况，应该是你诱导表达的蛋白没有活性吧？
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2楼2010-01-28 16:24:14
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yang0071

木虫 (职业作家)
zjwang(金币+1): 2010-01-28 17:41
使用的检测抗体是啥？目的蛋白分子量多少？大分子的话，可能空间构象上覆盖GST的抗体识别区域。建议使用目的蛋白的特异抗体
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3楼2010-01-28 16:31:26
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zjwang

木虫 (正式写手)
用gst抗体检测的，目的蛋白大约77k，加上gst差不多103k。像你说的空间构象覆盖gst抗体识别区几率有多大？没有目的蛋白的特异抗体。这个蛋白诱导后想过柱子纯化，这样western检测不出来不知道能不能过柱子。
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4楼2010-01-28 17:11:51
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sutao1979

木虫 (著名写手)

小木虫10年groupleader
zjwang(金币+1): 2010-01-28 17:40
平行做，诱导的和没诱导的loading到gel上，明确是否真的诱导出来了，如果没问题，western blot没有带，说明蛋白没活性
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会当凌绝顶，一览众山小
5楼2010-01-28 17:34:05
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zjwang

木虫 (正式写手)
没有活性western检测不出来？你的意思是蛋白没有形成正确的高级结构？
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6楼2010-01-28 17:40:28
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zjwang

木虫 (正式写手)
有没有解决的办法？
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7楼2010-01-28 17:41:07
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sutao1979

木虫 (著名写手)

小木虫10年groupleader
问一句你的蛋白是在上清还是包涵体里？
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会当凌绝顶，一览众山小
8楼2010-01-28 17:45:06
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towindflower

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by zjwang at 2010-01-28 15:00:29:
最近做western blot的时候出现一点问题：我用的是GST标签，诱导蛋白走sds-page能看到诱导后出现一条新的带，但是western检测没有，而作为对照的空载体有GST条带。不知道怎么回事，大家有没有遇到过，求指点！谢过！

看你用的什么抗体了,而且肉眼都能看到的条带还需要做western?
如果用的抗体正确那就可能有两个原因:1.western 不过关,2.蛋白表达错了
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9楼2010-01-28 17:51:53
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zjwang

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by sutao1979 at 2010-01-28 17:45:06:
问一句你的蛋白是在上清还是包涵体里？

不知道，用全菌体蛋白走的电泳
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10楼2010-01-28 18:01:43
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