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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】如何做菌落PCR?
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greatsaint

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】如何做菌落PCR?

最近想做菌落PCR，但是不知道具体如何操作，特别是需要注意什么问题，请大家帮忙。谢谢！
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1楼 2010-01-27 10:58:23
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★
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我的步骤：
1：挑取单克隆入小离心管，进行裂解（15Min);
2：往离心管加入PCR的物质（buffer 酶，DMSO，引物等），然后分装（看你做多少体系了）；
3：待模板裂解完毕，加入模板，然后进行PCR！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
8楼2010-01-27 13:49:23
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IDname

捐助贵宾 (正式写手)

钢虫
★
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就是用菌落代替模板，把单菌落挑出来放进PCR体系，开始P
挑单菌落可以用PCR clean的tips，注意尽量别挑培养基
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2楼2010-01-27 11:43:46
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挥汗如雨

至尊木虫 (职业作家)
★
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我们操作方法如下：
1. 在1.5 ml的离心管中加入0.5 ml 液体培养基；
2. 用牙签或小枪头挑取平板上的菌落单斑；
3: 带有菌的牙签放入离心管，然后取出，盖好盖子过夜摇菌培养；
4: 20微升PCR体系，加入摇好的菌液1微升,35个循环；
5: 剩余菌液保存菌种。
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人生有三样东西不可挽回：时间，机遇，还有说出去的话。
3楼2010-01-27 12:40:34
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hongrunge

铁杆木虫 (小有名气)
★
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楼上的感觉和菌液PCR没什么区别。
直接用灭过菌的牙签挑取少量菌体至tube中，加入配好的体系即可。
挑取的菌体不要太多，tube管底可见淡淡的菌体痕迹即可；挑入菌体量过多反而容易干扰试验，造成非特异性扩增等不良后果
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4楼2010-01-27 12:56:31
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gyesang

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★
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引用回帖:
Originally posted by 挥汗如雨 at 2010-01-27 12:40:34:
我们操作方法如下：
1. 在1.5 ml的离心管中加入0.5 ml 液体培养基；
2. 用牙签或小枪头挑取平板上的菌落单斑；
3: 带有菌的牙签放入离心管，然后取出，盖好盖子过夜摇菌培养；
4: 20微升PCR体系，加入摇好的菌 ...

这样做还是略显麻烦
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5楼2010-01-27 13:07:08
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gyesang

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引用回帖:
Originally posted by hongrunge at 2010-01-27 12:56:31:
楼上的感觉和菌液PCR没什么区别。
直接用灭过菌的牙签挑取少量菌体至tube中，加入配好的体系即可。
挑取的菌体不要太多，tube管底可见淡淡的菌体痕迹即可；挑入菌体量过多反而容易干扰试验，造成非特异性扩增等 ...

菌体过多会扩不出来带来，反而全滞留在胶孔里面，电泳的时候
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
6楼2010-01-27 13:08:03
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gyesang

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★
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我通常会这样做：
第一种方法：
在PCR管子里面先加上10ul的水，然后编上号1，2，3，4，5，6，7.。。。。。。同时在一块新的LB固体平板上，画上格子也编上号1，2，3，4，5，6，7.。。。。。。。。，然后开始挑菌，第一个，先在平板上的标1号处，划上二到三下，然后再在标1号的PCR管吹洗几下，以此类推，然后平板放培养箱培养，稀释有菌体的水做模板，正常做PCR，跑完后电泳，确定结果，在平板上把阳性克隆用笔画出
第二种方法：
上面的稀释有菌体的水取一部分做PCR，剩余的部分4度或者冰上保存，等PCR结束电泳后，直接挑阳性克隆的水放到液体LB培养基培养就可以了，这步就不用画板子了，但这种方法有缺陷，就是没有划到新板子上以后菌取用起来方便
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7楼2010-01-27 13:16:21
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
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挑菌落放到10ul水中，混匀后，取1ulPCR，这样可以保证浓度不会太大，也不会有培养基的干扰
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9楼2010-01-27 13:58:00
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qqsvery

木虫 (著名写手)
菌落PCR（Colony PCR）可不必提取基因组DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省时少力。建议使用载体上的通用引物。通常利用此方法进行重组体的筛选或者DNA测序分析。最后的PCR产物大小是载体通用引物之间的插入片断大小。

详细方法给你个网站，仔细看看吧：

菌落PCR（Colony PCR）方法
http://www.bbioo.com/bio101/2007/19750.htm
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谎言和真实在河边洗澡，谎言先洗好，穿走了真实的衣服，真实却不肯穿谎言的衣服。后来人们眼里只有穿着真实衣服的谎言，却很难接受赤裸裸的真实。
10楼2010-01-27 14:19:21
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