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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR 循环设置问题求助,附PCR后电泳图！！！
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR 循环设置问题求助,附PCR后电泳图！！！

本人想通过PCR引物延伸的办法，2次延伸在已有序列A后面延伸66BP序列B，引物已由公司合成完毕，现准备进行PCR,但之前没有做过延伸PCR，希望各位虫子出谋划策，不胜感激！
第一次延伸引物
引物1：5‘TTTGGTACCACCCAGTCTCCAG3’
引物2：5’TGTCTCTGGCGGTAATATCTGCTCCGGCTCTGGCTGCGGGAGACGGTGACCGT‘3
第二次延伸引物
引物1：5‘TTTGGTACCACCCAGTCTCCAG’3
引物3：5’TTTAAGCTTTCAGCTCCGCCTCCTTCGTCTGCGACTTCTTTGTCTCTGGCGGT‘3

引物1：GC：54.5%   TM 51.0°C  22bp
引物2：GC：62.3%   TM 69.0°C  53 bp
引物3：GC：52.8°C   TM 69.0°C  53bp
先通过引物1，2延伸B中的38Bp，再通过引物1，3延伸B中剩下38bp,
蓝色部分为第一次延伸搭在A序列部分的15bp，红色部分为第二次延伸搭在第一次延伸过后的部分. 请大家帮忙设置下PCR循环及温度！谢谢！

实验性的设计了一下
95℃ 5min
95℃ 30' 56℃ 30' 72℃ 30'  5CYCLES
95℃ 30' 60℃ 30' 72℃ 30'  10CYCLES
95℃ 30' 65℃ 30' 72℃ 30'  10CYCLES
72℃ 5min
不知道结果如何 正在跑电泳，什么样的结果算是比较理想呢？  
新手跑电泳，跑的不好，大家多提意见
第2到时MARKER  DL2000，第3道是PCR产物，可以看到引物二聚体

[ Last edited by jiangkuo0520 on 2010-1-21 at 20:13 ]
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1楼 2010-01-21 15:46:18
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李彦辉

铜虫 (正式写手)
好复杂啊，只做过普通PCR,,帮你顶一下，免沉
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2楼2010-01-21 15:54:44
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)
等待中。。。。。。
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3楼2010-01-21 16:44:00
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ckany

银虫 (正式写手)
我也只做过普通的
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4楼2010-01-21 16:57:13
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yzhang1986

铁杆木虫 (文坛精英)

优秀版主
没做过
学习一下
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5楼2010-01-21 17:00:45
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)
关键做课题没钱啊，有钱直接找公司合成，也就800元左右，通过延伸的话算下来也不过100左右，呵呵！继续等待
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6楼2010-01-21 17:07:55
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+3,VIP+0): 1-21 17:38
jiangkuo0520(金币+2,VIP+0):谢谢你的意见！ 1-21 18:57
是有点困难：
   你试试这个：
第一次PCR     退火温度  45℃       5cycles
                   退火温度  50℃       5cycles
                   退火温度  55℃       5cycles
                   退火温度  65℃       25cycles

第二次PCR      退火温度  45℃       5cycles
                   退火温度  50℃       5cycles
                   退火温度  55℃       5cycles
                   退火温度  60℃       25cycles

你得自己试试不好说，确实有点复杂。看看不行的话，再把最后一步温度降低些
。其实你设计一条长引物也好点。
其实引物1你可以加长些
赞一下(22人) 回复此楼
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
7楼2010-01-21 17:30:27
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jerryqpr

木虫 (正式写手)

小猪亲点的老公
★
jiangkuo0520(金币+1,VIP+0): 1-21 18:59
个人感觉 你只要在pcr的时候把退火的时间稍微延长点就可以了，pcr的引物退火温度的话只跟能搭在模板上面的序列有关系，而且退火温度如果太低的话，你的引物这么长，引物二聚体的问题就很能影响你的pcr产量了。
我也做过延伸的，不过没有你这么长就是了，我最长的外面也就飘了20多bp，就按照普通的pcr的程序p，一样p得出来。
赞一下(2人) 回复此楼
铁杵可以磨成针,木杵只能磨成牙签,有些事情不是努力可以改变的.
8楼2010-01-21 18:27:42
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)
实验性的设计了一下
95℃ 5min
95℃ 30' 56℃ 30' 72℃ 30'  5CYCLES
95℃ 30' 60℃ 30' 72℃ 30'  10CYCLES
95℃ 30' 65℃ 30' 72℃ 30'  10CYCLES
72℃ 5min
不知道结果如何 正在跑电泳，什么样的结果算是比较理想呢？
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9楼2010-01-21 19:03:42
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by jerryqpr at 2010-1-21 18:27:
个人感觉 你只要在pcr的时候把退火的时间稍微延长点就可以了，pcr的引物退火温度的话只跟能搭在模板上面的序列有关系，而且退火温度如果太低的话，你的引物这么长，引物二聚体的问题就很能影响你的pcr产量了。
我 ...

PCR结束，电泳结果出来了！
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10楼2010-01-21 20:12:02
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