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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)

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专业: 肿瘤免疫

[交流] 【求助/交流】PCR 循环设置问题求助,附PCR后电泳图！！！

本人想通过PCR引物延伸的办法，2次延伸在已有序列A后面延伸66BP序列B，引物已由公司合成完毕，现准备进行PCR,但之前没有做过延伸PCR，希望各位虫子出谋划策，不胜感激！
第一次延伸引物
引物1：5‘TTTGGTACCACCCAGTCTCCAG3’
引物2：5’TGTCTCTGGCGGTAATATCTGCTCCGGCTCTGGCTGCGGGAGACGGTGACCGT‘3
第二次延伸引物
引物1：5‘TTTGGTACCACCCAGTCTCCAG’3
引物3：5’TTTAAGCTTTCAGCTCCGCCTCCTTCGTCTGCGACTTCTTTGTCTCTGGCGGT‘3

引物1：GC：54.5% TM 51.0°C  22bp
引物2：GC：62.3% TM 69.0°C  53 bp
引物3：GC：52.8°C TM 69.0°C  53bp
先通过引物1，2延伸B中的38Bp，再通过引物1，3延伸B中剩下38bp,
蓝色部分为第一次延伸搭在A序列部分的15bp，红色部分为第二次延伸搭在第一次延伸过后的部分. 请大家帮忙设置下PCR循环及温度！谢谢！

实验性的设计了一下
95℃ 5min
95℃ 30' 56℃ 30' 72℃ 30'  5CYCLES
95℃ 30' 60℃ 30' 72℃ 30'  10CYCLES
95℃ 30' 65℃ 30' 72℃ 30'  10CYCLES
72℃ 5min
不知道结果如何正在跑电泳，什么样的结果算是比较理想呢？
新手跑电泳，跑的不好，大家多提意见
第2到时MARKER  DL2000，第3道是PCR产物，可以看到引物二聚体

[ Last edited by jiangkuo0520 on 2010-1-21 at 20:13 ]

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1楼 2010-01-21 15:46:18

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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

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★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+3,VIP+0): 1-21 17:38
jiangkuo0520(金币+2,VIP+0):谢谢你的意见！ 1-21 18:57

是有点困难：
你试试这个：
第一次PCR    退火温度  45℃    5cycles
               退火温度  50℃    5cycles
               退火温度  55℃    5cycles
               退火温度  65℃    25cycles

第二次PCR    退火温度  45℃    5cycles
               退火温度  50℃    5cycles
               退火温度  55℃    5cycles
               退火温度  60℃    25cycles

你得自己试试不好说，确实有点复杂。看看不行的话，再把最后一步温度降低些
。其实你设计一条长引物也好点。
其实引物1你可以加长些