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jiangkuo0520金虫 (正式写手)
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[交流]
【求助/交流】PCR 循环设置问题求助,附PCR后电泳图！！！
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本人想通过PCR引物延伸的办法，2次延伸在已有序列A后面延伸66BP序列B，引物已由公司合成完毕，现准备进行PCR,但之前没有做过延伸PCR，希望各位虫子出谋划策，不胜感激！ 第一次延伸引物 引物1：5‘TTTGGTACCACCCAGTCTCCAG3’ 引物2：5’TGTCTCTGGCGGTAATATCTGCTCCGGCTCTGGCTGCGGGAGACGGTGACCGT‘3 第二次延伸引物 引物1：5‘TTTGGTACCACCCAGTCTCCAG’3 引物3：5’TTTAAGCTTTCAGCTCCGCCTCCTTCGTCTGCGACTTCTTTGTCTCTGGCGGT‘3 引物1：GC：54.5% TM 51.0°C 22bp 引物2：GC：62.3% TM 69.0°C 53 bp 引物3：GC：52.8°C TM 69.0°C 53bp 先通过引物1，2延伸B中的38Bp，再通过引物1，3延伸B中剩下38bp, 蓝色部分为第一次延伸搭在A序列部分的15bp，红色部分为第二次延伸搭在第一次延伸过后的部分. 请大家帮忙设置下PCR循环及温度！谢谢！ 实验性的设计了一下 95℃ 5min 95℃ 30' 56℃ 30' 72℃ 30' 5CYCLES 95℃ 30' 60℃ 30' 72℃ 30' 10CYCLES 95℃ 30' 65℃ 30' 72℃ 30' 10CYCLES 72℃ 5min 不知道结果如何 正在跑电泳，什么样的结果算是比较理想呢？ 新手跑电泳，跑的不好，大家多提意见 第2到时MARKER DL2000，第3道是PCR产物，可以看到引物二聚体 [ Last edited by jiangkuo0520 on 2010-1-21 at 20:13 ] |
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amisking(金币+3,VIP+0): 1-21 17:38
jiangkuo0520(金币+2,VIP+0):谢谢你的意见！ 1-21 18:57
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jiangkuo0520(金币+2,VIP+0):谢谢你的意见！ 1-21 18:57
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是有点困难： 你试试这个： 第一次PCR 退火温度 45℃ 5cycles 退火温度 50℃ 5cycles 退火温度 55℃ 5cycles 退火温度 65℃ 25cycles 第二次PCR 退火温度 45℃ 5cycles 退火温度 50℃ 5cycles 退火温度 55℃ 5cycles 退火温度 60℃ 25cycles 你得自己试试不好说，确实有点复杂。看看不行的话，再把最后一步温度降低些 。其实你设计一条长引物也好点。 其实引物1你可以加长些 |
7楼2010-01-21 17:30:27
好复杂啊，只做过普通PCR,
,帮你顶一下，免沉 2楼2010-01-21 15:54:44
jiangkuo0520
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