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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR 循环设置问题求助,附PCR后电泳图!!!

本人想通过PCR引物延伸的办法,2次延伸在已有序列A后面延伸66BP序列B,引物已由公司合成完毕,现准备进行PCR,但之前没有做过延伸PCR,希望各位虫子出谋划策,不胜感激!
第一次延伸引物
引物1:5‘TTTGGTACCACCCAGTCTCCAG3’
引物2:5’TGTCTCTGGCGGTAATATCTGCTCCGGCTCTGGCTGCGGGAGACGGTGACCGT‘3
第二次延伸引物
引物1:5‘TTTGGTACCACCCAGTCTCCAG’3
引物3:5’TTTAAGCTTTCAGCTCCGCCTCCTTCGTCTGCGACTTCTTTGTCTCTGGCGGT‘3

引物1:GC:54.5%   TM 51.0°C  22bp
引物2:GC:62.3%   TM 69.0°C  53 bp
引物3:GC:52.8°C   TM 69.0°C  53bp
先通过引物1,2延伸B中的38Bp,再通过引物1,3延伸B中剩下38bp,
蓝色部分为第一次延伸搭在A序列部分的15bp,红色部分为第二次延伸搭在第一次延伸过后的部分. 请大家帮忙设置下PCR循环及温度!谢谢!

实验性的设计了一下
95℃ 5min
95℃ 30' 56℃ 30' 72℃ 30'  5CYCLES
95℃ 30' 60℃ 30' 72℃ 30'  10CYCLES
95℃ 30' 65℃ 30' 72℃ 30'  10CYCLES
72℃ 5min
不知道结果如何 正在跑电泳,什么样的结果算是比较理想呢?  

新手跑电泳,跑的不好,大家多提意见
第2到时MARKER  DL2000,第3道是PCR产物,可以看到引物二聚体

[ Last edited by jiangkuo0520 on 2010-1-21 at 20:13 ]
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)

实验性的设计了一下
95℃ 5min
95℃ 30' 56℃ 30' 72℃ 30'  5CYCLES
95℃ 30' 60℃ 30' 72℃ 30'  10CYCLES
95℃ 30' 65℃ 30' 72℃ 30'  10CYCLES
72℃ 5min
不知道结果如何 正在跑电泳,什么样的结果算是比较理想呢?
9楼2010-01-21 19:03:42
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李彦辉

铜虫 (正式写手)

好复杂啊,只做过普通PCR,,帮你顶一下,免沉
2楼2010-01-21 15:54:44
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)

等待中。。。。。。
3楼2010-01-21 16:44:00
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ckany

银虫 (正式写手)

我也只做过普通的
4楼2010-01-21 16:57:13
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