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jiangkuo0520金虫 (正式写手)
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[交流]
【求助/交流】PCR 循环设置问题求助,附PCR后电泳图!!!
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本人想通过PCR引物延伸的办法,2次延伸在已有序列A后面延伸66BP序列B,引物已由公司合成完毕,现准备进行PCR,但之前没有做过延伸PCR,希望各位虫子出谋划策,不胜感激! 第一次延伸引物 引物1:5‘TTTGGTACCACCCAGTCTCCAG3’ 引物2:5’TGTCTCTGGCGGTAATATCTGCTCCGGCTCTGGCTGCGGGAGACGGTGACCGT‘3 第二次延伸引物 引物1:5‘TTTGGTACCACCCAGTCTCCAG’3 引物3:5’TTTAAGCTTTCAGCTCCGCCTCCTTCGTCTGCGACTTCTTTGTCTCTGGCGGT‘3 引物1:GC:54.5% TM 51.0°C 22bp 引物2:GC:62.3% TM 69.0°C 53 bp 引物3:GC:52.8°C TM 69.0°C 53bp 先通过引物1,2延伸B中的38Bp,再通过引物1,3延伸B中剩下38bp, 蓝色部分为第一次延伸搭在A序列部分的15bp,红色部分为第二次延伸搭在第一次延伸过后的部分. 请大家帮忙设置下PCR循环及温度!谢谢! 实验性的设计了一下 95℃ 5min 95℃ 30' 56℃ 30' 72℃ 30' 5CYCLES 95℃ 30' 60℃ 30' 72℃ 30' 10CYCLES 95℃ 30' 65℃ 30' 72℃ 30' 10CYCLES 72℃ 5min 不知道结果如何 正在跑电泳,什么样的结果算是比较理想呢? 新手跑电泳,跑的不好,大家多提意见 第2到时MARKER DL2000,第3道是PCR产物,可以看到引物二聚体 [ Last edited by jiangkuo0520 on 2010-1-21 at 20:13 ] |
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yzhang1986
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jiangkuo0520
金虫 (正式写手)
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3楼2010-01-21 16:44:00
4楼2010-01-21 16:57:13














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好复杂啊,只做过普通PCR,
,帮你顶一下,免沉