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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教质粒PCR跑不出目的条带的原因
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wmy712100

铁虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】请教质粒PCR跑不出目的条带的原因

我的试验是：链接转化后，进行蓝白斑筛选，挑取单菌进行菌落PCR后电泳检测得到我的目的条带为1014bp,然后摇菌，使用天根的质粒小提试剂盒提取质粒后,将质粒稀释100倍，取1ul进行质粒PCR,PCR的条件和菌落PCR条件一样，都进行40个循环，结果却只在100bp有一条带，却没有我的目的条带。
请各位高手帮忙分析一下原因。谢谢。
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1楼 2010-01-15 22:09:32
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★ ★
wmy712100(金币+2):谢谢参与
1949stone(金币+1,VIP+0): 1-16 10:56
已经质粒回收了，建议酶切检测，比PCR简单，还可靠
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2楼2010-01-15 22:12:23
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wmy712100

铁虫 (初入文坛)
谢谢。我也想做酶切，可老板不舍得花钱买酶，只让做PCR,所以必须PCR做出来，才让送出去测序。
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3楼2010-01-15 22:19:02
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pengl001

木虫 (小有名气)
★ ★
wmy712100(金币+2):谢谢参与
1949stone(金币+1,VIP+0): 1-16 10:56
I come croos the same problem,and I want to use enzyme but my boss care a lot for money,I have to do PCR over again and again
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Yes,Ican!
4楼2010-01-16 00:48:11
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358219418

金虫 (正式写手)
★ ★
wmy712100(金币+2):谢谢参与
1949stone(金币+1,VIP+0): 1-16 10:56
先多做两次PCR，实在不行就直接做下一步，也许就出来了
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木虫，快乐并坚强着
5楼2010-01-16 10:18:40
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沙中清泉

木虫 (正式写手)
★ ★
wmy712100(金币+2):谢谢参与
1949stone(金币+1,VIP+0): 1-16 10:56
有可能你就没连上T载，做个阳性对照看看
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6楼2010-01-16 10:32:49
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85715623

木虫 (正式写手)
★ ★
wmy712100(金币+2):谢谢参与
1949stone(金币+1,VIP+0): 1-16 10:57
对，很可能就是连接反应没成功。可以把质粒电泳一下，看看与ck有什么区别，没有的话就重新连接吧。PCR产物浓度也是一个很关键的因素。
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7楼2010-01-16 10:45:21
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
菌液PCR假阳性多。能P出来不一定连进了你的目的片段。建议菌液PCR多筛几个阳性，提质粒做酶切。你不可能省掉酶切的钱，最可行的还是酶切。
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Thank-you，so-blue.
8楼2010-01-16 14:04:28
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wmy712100

铁虫 (初入文坛)
谢谢大家给的建议，我再试试
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9楼2010-01-16 20:08:59
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wmy712100

铁虫 (初入文坛)
虽然我质粒PCR没有得到我想要的目的条带，但是我直接送出去测序了，我刚刚得到结果，是测序成功，所以我想说如果你这一步不成功的话，可以送出去测序试试。谢谢大家对我试验的帮助，希望有机会也能够帮助大家。
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10楼2010-01-22 14:07:05
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