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wmy712100

铁虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】请教质粒PCR跑不出目的条带的原因

我的试验是:链接转化后,进行蓝白斑筛选,挑取单菌进行菌落PCR后电泳检测得到我的目的条带为1014bp,然后摇菌,使用天根的质粒小提试剂盒提取质粒后,将质粒稀释100倍,取1ul进行质粒PCR,PCR的条件和菌落PCR条件一样,都进行40个循环,结果却只在100bp有一条带,却没有我的目的条带。
请各位高手帮忙分析一下原因。谢谢。
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

★ ★
wmy712100(金币+2):谢谢参与
1949stone(金币+1,VIP+0): 1-16 10:56
已经质粒回收了,建议酶切检测,比PCR简单,还可靠
2楼2010-01-15 22:12:23
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wmy712100

铁虫 (初入文坛)

谢谢。我也想做酶切,可老板不舍得花钱买酶,只让做PCR,所以必须PCR做出来,才让送出去测序。
3楼2010-01-15 22:19:02
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pengl001

木虫 (小有名气)

★ ★
wmy712100(金币+2):谢谢参与
1949stone(金币+1,VIP+0): 1-16 10:56
I come croos the same problem,and I want to use enzyme but my boss care a lot for money,I have to do PCR over again and again
Yes,Ican!
4楼2010-01-16 00:48:11
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358219418

金虫 (正式写手)

★ ★
wmy712100(金币+2):谢谢参与
1949stone(金币+1,VIP+0): 1-16 10:56
先多做两次PCR,实在不行就直接做下一步,也许就出来了
木虫,快乐并坚强着
5楼2010-01-16 10:18:40
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沙中清泉

木虫 (正式写手)

★ ★
wmy712100(金币+2):谢谢参与
1949stone(金币+1,VIP+0): 1-16 10:56
有可能你就没连上T载,做个阳性对照看看
6楼2010-01-16 10:32:49
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85715623

木虫 (正式写手)

★ ★
wmy712100(金币+2):谢谢参与
1949stone(金币+1,VIP+0): 1-16 10:57
对,很可能就是连接反应没成功。可以把质粒电泳一下,看看与ck有什么区别,没有的话就重新连接吧。PCR产物浓度也是一个很关键的因素。
7楼2010-01-16 10:45:21
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
菌液PCR假阳性多。能P出来不一定连进了你的目的片段。建议菌液PCR多筛几个阳性,提质粒做酶切。你不可能省掉酶切的钱,最可行的还是酶切。
Thank-you,so-blue.
8楼2010-01-16 14:04:28
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wmy712100

铁虫 (初入文坛)

谢谢大家给的建议,我再试试
9楼2010-01-16 20:08:59
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wmy712100

铁虫 (初入文坛)

虽然我质粒PCR没有得到我想要的目的条带,但是我直接送出去测序了,我刚刚得到结果,是测序成功,所以我想说如果你这一步不成功的话,可以送出去测序试试。谢谢大家对我试验的帮助,希望有机会也能够帮助大家。
10楼2010-01-22 14:07:05
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