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gn2003_0

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[交流] 【分享】基因组DNA质量检测

一、技术方法
对于基因组DNA质量检测主要包括：基因组DNA片段大小的确定，基因组DNA浓度的测定，基因组DNA纯度的测定三方面。
用到的技术方法有：琼脂糖凝胶电泳，使用紫外分光光度计测定基因组DNA溶液的OD值
二、试剂
琼脂糖
溴化乙锭（终浓度0.5μg/ml）
6×上样缓冲溶液
λDNA溶液（50ng/μl）
三、仪器
电泳仪
凝胶成像仪
紫外分光光度计
四、操作流程
1. 琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA片段的大小
制作浓度为0.5%（w/v）的琼脂糖胶。
依次取1μl、2μl DNA溶液，混合6×上样缓冲溶液均匀，上样。
同时点λDNA溶液1μl或2μl作为Marker。
1-2V/cm电泳约12-16h。
2. 使用紫外分光光度计测定基因组DNA溶液的OD值
对DNA溶液样品进行稀释，一般稀释百倍。
取DNA稀释液测定OD260与OD280。
按1 OD260=50ng/μl计算基因组DNA原液的浓度，即50×OD260 ×稀释倍数。
计算OD260/OD280值。
五、注意事项
1.λDNA约48kb，用来指示所提DNA的大小。一般要求所提DNA大小在50kb以上。
2. DNA的纯制品的OD260/OD280值为1.8，而RNA的纯制品的OD260/OD280值为2.0。若OD260/OD280值高于1.8，那么说样品中可能有RNA的污染；若样品中蛋白或酚的污染较严重则OD260/OD280值低于上述两个值。
3.用紫外分光光度计测量OD值时，应控制读数在0.01-2之间，即DNA的稀释倍数要适当。
4. 紫外分光光度计法适应浓度较高并且较纯的样品的定量。核酸在260nm处的吸收非常强，只有存在高水平蛋白污染的情况下才会引起260nm、280nm两个波长下吸光度比值的大幅度改变。因此如果A260/A280值低于1.8，那么就不能通过此法对DNA样品进行精确定量。
参考文献
1．[美]J.萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔著,黄培堂等译.分子克隆实验指南(第三版).北京:科学出版社,2002.8.

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1楼 2010-01-15 16:41:57

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yujiaping1

木虫 (著名写手)

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1949stone(金币+0,VIP+0):要看片段大小 1-16 13:00

0.5%的琼脂糖胶检测DNA，会不会太小啊，一般不都是0.7-0.8%吗？有没有弄错啊

还有紫外分光光度计的读数应该控制在0.2-0.8之间最好，稍微差一些也没问题，但是0.01-2肯定有问题，我确定，范围太大

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2楼2010-01-15 17:04:26

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gn2003_0

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引用回帖:

Originally posted by gn2003_0 at 2010-1-15 16:41:
一、技术方法
对于基因组DNA质量检测主要包括：基因组DNA片段大小的确定，基因组DNA浓度的测定，基因组DNA纯度的测定三方面。
用到的技术方法有：琼脂糖凝胶电泳，使用紫外分光光度计测定基因组DNA溶液的OD值
...

0.5%琼脂糖检测确实有点小。但是也是根据你提取DNA大小而言的。
紫外分光范围确实说大了，但是DNA的纯制品的OD260/OD280值为1.8！！

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3楼2010-01-15 17:11:00

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