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yygz5128

[交流] 【求助/交流】求救-新基因的克隆

我现在正在克隆一个新基因,根据其已知的氨基酸序列通过兼并PCR的方法已经获得中间的部分序列(没有同源性,只知道氨基酸序列),买了CLOTECH的RACE试剂盒想获得全长CDNA,一直没有结果,请问还有哪些比较好的末端克隆的方法,请高手们指教,万分感谢
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liuyanyy

新虫 (正式写手)

通过染色体步移的方法
2楼2010-01-05 23:33:51
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yujiaping1

木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
clontech的盒子足够好了,一定可以做出来的,可以多设计几个引物,一次出不来,做巢式PCR,多种组合的巢式PCR
一般情况3’-RACE比较容易,但是5‘-RACE可能相对困难,但是用clontech的盒子很好用,问题不大
另外注意设计引物的时候避免以A结尾,尽量以T结尾
3楼2010-01-06 16:23:48
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yygz5128

也尝试了染色体步移的方法,值得到部分序列,连已知的序列都没有全部出来,奇怪了
4楼2010-01-17 22:36:25
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yygz5128

引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-1-6 16:23:
clontech的盒子足够好了,一定可以做出来的,可以多设计几个引物,一次出不来,做巢式PCR,多种组合的巢式PCR
一般情况3’-RACE比较容易,但是5‘-RACE可能相对困难,但是用clontech的盒子很好用,问题不大
另外 ...

你说的我都试了,引物差不多设计了10对了,一直没有结果,巢式PCR也只是模糊的一片,哎,郁闷了
5楼2010-01-17 22:38:13
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jasco

木虫 (正式写手)

先攻3'race,这个容易些
6楼2010-01-18 11:06:56
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qianggene

铜虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
我也是啊,5'做了两个月了,单一条带都出来了,可就是不对,我都无奈了~
7楼2010-01-18 13:49:43
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-1-6 16:23:
clontech的盒子足够好了,一定可以做出来的,可以多设计几个引物,一次出不来,做巢式PCR,多种组合的巢式PCR
一般情况3’-RACE比较容易,但是5‘-RACE可能相对困难,但是用clontech的盒子很好用,问题不大
另外 ...

非常同意
8楼2010-01-18 15:59:36
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yujiaping1

木虫 (著名写手)


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引用回帖:
Originally posted by yygz5128 at 2010-1-17 22:38:

你说的我都试了,引物差不多设计了10对了,一直没有结果,巢式PCR也只是模糊的一片,哎,郁闷了

这种情况,我怀疑跟你的RNA有关系,是不是基因丰度太低,我一般设计两对3’RACE就能跑出来,很多情况是两对引物都效果较好,我选择较长的那个测序,以备有足够长的序列设计5‘RACE
9楼2010-01-18 16:01:24
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段家一凡

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
Clontech的应该是做5‘Race最好的试剂盒了,我想你应该吧引物尽量设计的Tm值高一点,直接用72度完事
10楼2010-01-18 21:47:42
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