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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求救-新基因的克隆
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yygz5128

[交流] 【求助/交流】求救-新基因的克隆

我现在正在克隆一个新基因，根据其已知的氨基酸序列通过兼并PCR的方法已经获得中间的部分序列（没有同源性，只知道氨基酸序列），买了CLOTECH的RACE试剂盒想获得全长CDNA，一直没有结果，请问还有哪些比较好的末端克隆的方法，请高手们指教，万分感谢
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1楼 2010-01-05 23:26:35
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liuyanyy

新虫 (正式写手)
通过染色体步移的方法
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2楼2010-01-05 23:33:51
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
clontech的盒子足够好了，一定可以做出来的，可以多设计几个引物，一次出不来，做巢式PCR，多种组合的巢式PCR
一般情况3’-RACE比较容易，但是5‘-RACE可能相对困难，但是用clontech的盒子很好用，问题不大
另外注意设计引物的时候避免以A结尾，尽量以T结尾
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3楼2010-01-06 16:23:48
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yygz5128

也尝试了染色体步移的方法，值得到部分序列，连已知的序列都没有全部出来，奇怪了
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4楼2010-01-17 22:36:25
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yygz5128

引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-1-6 16:23:
clontech的盒子足够好了，一定可以做出来的，可以多设计几个引物，一次出不来，做巢式PCR，多种组合的巢式PCR
一般情况3’-RACE比较容易，但是5‘-RACE可能相对困难，但是用clontech的盒子很好用，问题不大
另外 ...

你说的我都试了，引物差不多设计了10对了，一直没有结果，巢式PCR也只是模糊的一片，哎，郁闷了
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5楼2010-01-17 22:38:13
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jasco

木虫 (正式写手)
先攻3'race，这个容易些
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6楼2010-01-18 11:06:56
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qianggene

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我也是啊，5'做了两个月了，单一条带都出来了，可就是不对，我都无奈了~
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7楼2010-01-18 13:49:43
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-1-6 16:23:
clontech的盒子足够好了，一定可以做出来的，可以多设计几个引物，一次出不来，做巢式PCR，多种组合的巢式PCR
一般情况3’-RACE比较容易，但是5‘-RACE可能相对困难，但是用clontech的盒子很好用，问题不大
另外 ...

非常同意
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8楼2010-01-18 15:59:36
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by yygz5128 at 2010-1-17 22:38:

你说的我都试了，引物差不多设计了10对了，一直没有结果，巢式PCR也只是模糊的一片，哎，郁闷了

这种情况，我怀疑跟你的RNA有关系，是不是基因丰度太低，我一般设计两对3’RACE就能跑出来，很多情况是两对引物都效果较好，我选择较长的那个测序，以备有足够长的序列设计5‘RACE
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9楼2010-01-18 16:01:24
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段家一凡

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
Clontech的应该是做5‘Race最好的试剂盒了，我想你应该吧引物尽量设计的Tm值高一点，直接用72度完事
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10楼2010-01-18 21:47:42
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