24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
汕头大学海洋科学接受调剂
查看: 795  |  回复: 9
当前主题已经存档。

qianggene

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】求助5‘race PCR 产物测序问题

给位虫友,大家好!我想请教一个问题,最近一直困惑我,我在克隆基因,只差5’没有得到,其中编码区大约是500多bp,UTR不知有多少,我用的是宝生物的5‘-full-race试剂盒,设计了几个引物,测了很多次序,可结果总是不对,而且,常常是上下游引物都拿到,但依然不是我要的基因,把测序结果翻译过来的aa在NCBI 上blast,结果总是说这是个conserved hypothetical protein 。请高手给我一些建议,帮我解释一下这到底是怎么回事,谢谢啦!
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yujiaping1

木虫 (著名写手)

★ ★ ★
1949stone(金币+2,VIP+0):谢谢交流 12-28 17:08
qianggene(金币+1,VIP+0): 12-30 20:16
上下游引物都对了,怎么可能不是你要的基因呢,真奇怪,难道你设计的引物和那个conserved hypothetical protein的序列有相同的地方?而且多对引物都显示你要的基因就是它,那么一定不会错啊
2楼2009-12-28 15:52:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qianggene

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2009-12-28 15:52:
上下游引物都对了,怎么可能不是你要的基因呢,真奇怪,难道你设计的引物和那个conserved hypothetical protein的序列有相同的地方?而且多对引物都显示你要的基因就是它,那么一定不会错啊

但真的就不是我想要的基因啊,除了引物那块相同,其他都不一样,郁闷啊~
3楼2009-12-29 13:18:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主


qianggene(金币+1,VIP+0): 12-30 20:15
设计过好几次下游引物,并且每次豆能测到引物序列吗?那就奇怪了。你可以利用不同的下游引物做次巢式PCR吧,看看怎么样。
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2009-12-29 14:32:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

vegsum

捐助贵宾 (小有名气)


qianggene(金币+1,VIP+0): 12-30 20:15
下游引物做次巢式PCR
5楼2009-12-29 15:18:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jasco

木虫 (正式写手)


qianggene(金币+1,VIP+0): 12-30 20:15
你得到的序列有多少和你已知序列能匹配?
你的目的基因有多种转录本存在么?
6楼2009-12-29 17:04:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

thinka

铜虫 (著名写手)


qianggene(金币+1,VIP+0): 12-30 20:15
呵呵,这种现象经常碰到,做race,尤其是钓丰度低、序列GC含量极端、目的片断巨长的时候。引物很重要,序列的分析很重要,一链也很重要,我比较喜欢用invitrogen的race kit。从试剂盒原理上来说更容易拿到5 race的全长,有幸拿到过一些4、5k以上的基因。
7楼2009-12-29 17:06:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qianggene

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by vegsum at 2009-12-29 15:18:
下游引物做次巢式PCR

请问什么叫次巢式PCR ?是不是三条下游引物,三次PCR?
8楼2009-12-30 20:10:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qianggene

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by jasco at 2009-12-29 17:04:
你得到的序列有多少和你已知序列能匹配?
你的目的基因有多种转录本存在么?

只有引物匹配,再往前就都不对啊。没有查过转录本。
9楼2009-12-30 20:18:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yangym1123

木虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by qianggene at 2009-12-28 14:41:
给位虫友,大家好!我想请教一个问题,最近一直困惑我,我在克隆基因,只差5’没有得到,其中编码区大约是500多bp,UTR不知有多少,我用的是宝生物的5‘-full-race试剂盒,设计了几个引物,测了很多次序,可结果总 ...

这种情况是正常的,我也碰到过,UTR本身就不保守,有可能很长,也可能很短。所以,做RACE是时PCR的延伸时间要长一点,可以两分钟,反转录之前保证RNA的完整性和纯度!
10楼2009-12-31 08:57:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 qianggene 的主题更新
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 通信工程求调剂!!! +4 zlb770521 2026-04-14 4/200 2026-04-14 18:19 by lbsjt
[考研] 药学305求调剂 +5 玛卡巴卡boom 2026-04-11 5/250 2026-04-14 18:11 by 逍遥三郎
[考研] 297,工科调剂? +6 河南农业大学-能 2026-04-14 6/300 2026-04-14 16:04 by Art1977
[考研] 各位老师好,求调剂,本科211,一志愿天津大学生物与医药学硕,差两名录取。 +11 路六六jjj 2026-04-13 11/550 2026-04-14 16:01 by zs92450
[考研] 生物学调剂 +7 纸扇zhishan 2026-04-13 7/350 2026-04-14 14:21 by jyl0317
[考研] 人工智能320调剂08工类还有机会吗 +18 振—TZ 2026-04-10 19/950 2026-04-14 10:34 by screening
[考研] 085600材料与化工329分求调剂 +24 叶zilin 2026-04-13 25/1250 2026-04-14 09:20 by 试管破裂
[考研] 一志愿哈工大 085600 277 12材科基求调剂 5+5 chenny174 2026-04-10 37/1850 2026-04-14 07:39 by Abskk
[考研] 求调剂,985材料与化工348分 +9 涵竹刘 2026-04-11 14/700 2026-04-13 22:26 by 涵竹刘
[考研] 一志愿0807 数一英一 313 有没有二轮调剂 +12 emokidd 2026-04-08 13/650 2026-04-13 08:32 by lhj2009
[考研] +10 李多米lee. 2026-04-12 11/550 2026-04-12 22:58 by yuyin1233
[考研] 295分求调剂 +13 ?要上岸? 2026-04-10 13/650 2026-04-12 15:37 by laoshidan
[考研] 一志愿华中农微生物,288分,三年实验经历 +11 代fish 2026-04-09 11/550 2026-04-12 10:21 by Hayaay
[考研] 求调剂,一志愿材料科学与工程985,365分, +8 材化李可 2026-04-11 10/500 2026-04-12 08:42 by 852137818
[考研] 材料与化工300求调剂 +39 肖开文 2026-04-09 43/2150 2026-04-12 01:30 by 秋豆菜芽
[考研] 一志愿厦大0856,306求调剂 +15 Bblinging 2026-04-11 15/750 2026-04-11 22:53 by 314126402
[考研] 085506-求调剂-285分 +3 雷欧飞踢 2026-04-08 3/150 2026-04-11 08:37 by zhq0425
[考研] 309求调剂 +14 wdhw 2026-04-10 15/750 2026-04-10 21:06 by zhouxiaoyu
[考研] 已调剂 +18 柴郡猫_ 2026-04-09 19/950 2026-04-09 22:10 by 柴郡猫_
[考研] 296求调剂 +3 汪!?! 2026-04-08 3/150 2026-04-08 22:00 by zhouyuwinner
信息提示
请填处理意见