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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求助5‘race PCR 产物测序问题
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qianggene

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】求助5‘race PCR 产物测序问题

给位虫友，大家好！我想请教一个问题，最近一直困惑我，我在克隆基因，只差5’没有得到，其中编码区大约是500多bp,UTR不知有多少，我用的是宝生物的5‘-full-race试剂盒，设计了几个引物，测了很多次序，可结果总是不对，而且，常常是上下游引物都拿到，但依然不是我要的基因，把测序结果翻译过来的aa在NCBI 上blast,结果总是说这是个conserved hypothetical protein 。请高手给我一些建议，帮我解释一下这到底是怎么回事，谢谢啦！
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1楼 2009-12-28 14:41:30
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
1949stone(金币+2,VIP+0):谢谢交流 12-28 17:08
qianggene(金币+1,VIP+0): 12-30 20:16
上下游引物都对了，怎么可能不是你要的基因呢，真奇怪，难道你设计的引物和那个conserved hypothetical protein的序列有相同的地方？而且多对引物都显示你要的基因就是它，那么一定不会错啊
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2楼2009-12-28 15:52:09
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qianggene

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2009-12-28 15:52:
上下游引物都对了，怎么可能不是你要的基因呢，真奇怪，难道你设计的引物和那个conserved hypothetical protein的序列有相同的地方？而且多对引物都显示你要的基因就是它，那么一定不会错啊

但真的就不是我想要的基因啊，除了引物那块相同，其他都不一样，郁闷啊~
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3楼2009-12-29 13:18:06
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★
qianggene(金币+1,VIP+0): 12-30 20:15
设计过好几次下游引物，并且每次豆能测到引物序列吗？那就奇怪了。你可以利用不同的下游引物做次巢式PCR吧，看看怎么样。
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2009-12-29 14:32:23
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vegsum

捐助贵宾 (小有名气)
★
qianggene(金币+1,VIP+0): 12-30 20:15
下游引物做次巢式PCR
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5楼2009-12-29 15:18:54
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jasco

木虫 (正式写手)
★
qianggene(金币+1,VIP+0): 12-30 20:15
你得到的序列有多少和你已知序列能匹配？
你的目的基因有多种转录本存在么？
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6楼2009-12-29 17:04:00
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thinka

铜虫 (著名写手)
★
qianggene(金币+1,VIP+0): 12-30 20:15
呵呵,这种现象经常碰到,做race，尤其是钓丰度低、序列GC含量极端、目的片断巨长的时候。引物很重要，序列的分析很重要，一链也很重要，我比较喜欢用invitrogen的race kit。从试剂盒原理上来说更容易拿到5 race的全长，有幸拿到过一些4、5k以上的基因。
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7楼2009-12-29 17:06:08
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qianggene

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by vegsum at 2009-12-29 15:18:
下游引物做次巢式PCR

请问什么叫次巢式PCR ？是不是三条下游引物，三次PCR？
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8楼2009-12-30 20:10:38
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qianggene

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by jasco at 2009-12-29 17:04:
你得到的序列有多少和你已知序列能匹配？
你的目的基因有多种转录本存在么？

只有引物匹配，再往前就都不对啊。没有查过转录本。
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9楼2009-12-30 20:18:03
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yangym1123

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by qianggene at 2009-12-28 14:41:
给位虫友，大家好！我想请教一个问题，最近一直困惑我，我在克隆基因，只差5’没有得到，其中编码区大约是500多bp,UTR不知有多少，我用的是宝生物的5‘-full-race试剂盒，设计了几个引物，测了很多次序，可结果总 ...

这种情况是正常的，我也碰到过，UTR本身就不保守，有可能很长，也可能很短。所以，做RACE是时PCR的延伸时间要长一点，可以两分钟，反转录之前保证RNA的完整性和纯度！
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10楼2009-12-31 08:57:11
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