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qianggene

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】求助5‘race PCR 产物测序问题

给位虫友,大家好!我想请教一个问题,最近一直困惑我,我在克隆基因,只差5’没有得到,其中编码区大约是500多bp,UTR不知有多少,我用的是宝生物的5‘-full-race试剂盒,设计了几个引物,测了很多次序,可结果总是不对,而且,常常是上下游引物都拿到,但依然不是我要的基因,把测序结果翻译过来的aa在NCBI 上blast,结果总是说这是个conserved hypothetical protein 。请高手给我一些建议,帮我解释一下这到底是怎么回事,谢谢啦!
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qianggene

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2009-12-28 15:52:
上下游引物都对了,怎么可能不是你要的基因呢,真奇怪,难道你设计的引物和那个conserved hypothetical protein的序列有相同的地方?而且多对引物都显示你要的基因就是它,那么一定不会错啊

但真的就不是我想要的基因啊,除了引物那块相同,其他都不一样,郁闷啊~
3楼2009-12-29 13:18:06
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

★ ★ ★
1949stone(金币+2,VIP+0):谢谢交流 12-28 17:08
qianggene(金币+1,VIP+0): 12-30 20:16
上下游引物都对了,怎么可能不是你要的基因呢,真奇怪,难道你设计的引物和那个conserved hypothetical protein的序列有相同的地方?而且多对引物都显示你要的基因就是它,那么一定不会错啊
2楼2009-12-28 15:52:09
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主


qianggene(金币+1,VIP+0): 12-30 20:15
设计过好几次下游引物,并且每次豆能测到引物序列吗?那就奇怪了。你可以利用不同的下游引物做次巢式PCR吧,看看怎么样。
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2009-12-29 14:32:23
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vegsum

捐助贵宾 (小有名气)


qianggene(金币+1,VIP+0): 12-30 20:15
下游引物做次巢式PCR
5楼2009-12-29 15:18:54
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