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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求助：好点的反转录酶
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chener

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】求助：好点的反转录酶

最近通过RACE 拿到一个基因的5’ 和 3’ 端，现在想克隆这个基因的全长cDNA，有2800多bp，用常规的M-MLV反转录酶和dT18反转录总是不能扩增到全长，原因可能是反转录的时候没有延伸到5’ 端，所以想请教大家有没碰到过类似的问题，能不能推荐一个效率比较高的反转录酶。

[ Last edited by amisking on 2009-12-24 at 12:40 ]
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1楼 2009-12-24 10:36:07
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 12-24 12:40
chener(金币+2,VIP+0): 12-24 16:09
我原来用Stratagene公司有一个高保真的反转录酶，长度肯定没问题的，我记得看过好像是反转录20K都可以。
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2楼2009-12-24 12:37:50
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 12-24 13:06
chener(金币+2,VIP+0): 12-24 16:09
2.8K也不算很长啊，何况你RACE是分5’和3‘两方面进行的，你是用哪种RACE，即使是RACE，各家公司也是不尽相同的，你RNA的质量如何，
我做RACE用的就是MMLV(CLONTECH)，
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3楼2009-12-24 12:47:19
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amisking

荣誉版主 (文坛精英)

优秀区长优秀版主
★
chener(金币+1,VIP+0): 12-24 16:09
好像前一段时间也有人联系我要公司信息！
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如果没有人帮助你，那么你就去帮助别人。
4楼2009-12-24 13:07:05
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chener

金虫 (小有名气)
我是先拿到这个基因的一段中间序列，再通过RACE分别拿到这个基因的5’ 和3’ 部分，包括UTR，RACE是用Kit做的。现在我想拿到这个基因的全长cDNA,用常规的M-MLV和dT18反转录,再在5’ UTR和3’ UTR区设计引物扩增，总是扩增不到完整的片段。所以怀疑是反转录酶不够好。因为我用了好几对引物扩都不行。
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5楼2009-12-24 13:38:41
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yangym1123

木虫 (小有名气)
那你提取的RNA的质量怎么样？纯度呢？
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6楼2009-12-25 12:36:19
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gastrodia

金虫 (正式写手)
你设计引物不要在UTR部分，直接从ATG开始的25左右，下游从TAG向前数25左右的互补链即可
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7楼2009-12-25 13:15:23
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
chener(金币+2,VIP+0): 12-27 17:35
Invitrogen的SuperScript III
目前全世界最好的逆转录酶
当然价格也很对得起最好二字……

我用它就还没有遇到做不出来的……
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8楼2009-12-25 13:38:27
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thinka

铜虫 (著名写手)
★
chener(金币+1,VIP+0): 12-27 17:35
便宜点的就用primescript吧,小日本子的,我本不想推荐
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9楼2009-12-26 23:30:21
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
chener(金币+2,VIP+0): 12-27 17:35
如果要用便宜又要好点的就Fermentas的吧
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10楼2009-12-27 10:14:08
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