| 查看: 11183 | 回复: 51 | ||||||||||||
| 【奖励】 本帖被评价36次，作者wangjiange增加金币 26.4 个 | ||||||||||||
[资源]
【原创】细胞培养技术自己的总结
|
||||||||||||
|
贴壁细胞传代培养相关技术 （一）器材设备 培养瓶，吸管，橡皮头，离心管，广口瓶，滤器（大小），针管，冻存管，高压消毒器，培养箱，无菌工作台，CO2气罐，相差倒置显微镜，4℃冰箱，20℃冰箱，pH调节仪 （二）试剂配制 1）培养基的配制 使用前，加入小牛血清，使其浓度为10% 2）PBS配制（1000ml） NaCl 8.5g KCl 0.2g Na2HPO4•12H2O 2.85g KH2PO4 0.27g 上述试剂称量后加入800ml双蒸水中，搅拌至完全溶解，调节pH=7.2，用1000ml量筒定容，过滤除菌，4℃保存 3）胰酶配制 配制PBS液体100ml，0.25g胰酶（粉剂），EDTA 0.02g 加入其中，搅拌至完全溶解（约4小时，期间放入4℃冰箱一次，全程冰袋保护），调节pH=7.5，然后放入冰箱4℃过夜，次日过滤（或次日再调pH值过滤） 4）抗生素配制 80万单位青霉素+4ml PBS 100万单位链霉素+5ml PBS后取出4ml加入上述青霉素液中，充分混合之后，8ml液体分装，-20℃保存，每99ml培养基中加入青链霉素混合液0.1ml，其终浓度青霉素100u/ml；链霉素100ug/ml 5）冻存液配制 DSMO加入小牛血清，DSMO浓度为10%；注意，DSMO要避光保存。 （三）操作步骤 准备工作 试剂的准备（见试剂配制部分） 设备及器材的准备 确保操作台洁净，所用物品经过高压或者其他方式消毒 细胞复苏 1. 将冻存的细胞取出后迅速放入37℃水浴中，并不时摇动，在一分钟内使其完全融化 2. 将细胞吸出放入有培养基的离心管中中，用滴管轻轻吹打混匀，800转/min，5分钟离心；弃去上清液，加入培养基，混匀再离心一次，弃液，加入4~5ml 培养基，混匀，移入培养瓶中 细胞换液 1. 用旧液体轻轻冲洗培养瓶底，然后用滴管吸尽旧液（弃去） 2. 加入PBS1~2ml，轻轻摇晃，然后用滴管吸尽旧液（弃去） 3. 如果细胞液比较脏，可以重复步骤2 4. 加入新培养基，轻轻摇匀，放入培养箱继续培养 细胞传代 1. 用旧液体轻轻冲洗培养瓶底，然后用滴管吸尽旧液（弃去） 2. 加入PBS1~2ml，轻轻摇晃，然后用滴管吸尽旧液（弃去） 3. 加入约1~1.5ml胰酶，室温或培养箱中放置4~5分钟，直到所有贴壁细胞消化下来为止【判断方法：倒置相差显微镜观察，细胞变圆时就可以终止消化】 4. 加入约1ml培养基（含有小牛血清）终止消化 5. 用滴管吹洗一次，移入离心管, 800转/min，5分钟离心 6. 加入培养基，吹打分散细胞，再根据分传细胞瓶数补加一定量的含血清的培养基，制成细胞悬液；分装至2~3个培养瓶中 7. 放入培养箱进行培养 细胞计数 1. 准备好显微镜、载玻片、盖玻片、血细胞计数板、吸管等仪器设备 2. 按照“细胞传代”中讲述的方法制成细胞悬液 3. 将细胞悬液取出若干，滴入血细胞计数板，注意不要有气泡进入 4. 加样后静置2~3min后观察，数四角大格内的细胞总数。计数时应按照一定的路径，以免遗漏或重复。细胞压线时计上不计下，计左不计右，计数2~3次，取平均值 5. 细胞密度 = 四大格中细胞总数÷4 ×104 = 细胞数/ml悬液 细胞冻存 1. 重复“细胞传代”中的消化细胞的步骤，将细胞消化下来，转移至离心管800转/min，5分钟离心，弃液 2. 沉淀中加入冻存液，轻吹制成悬液 3. 分转到冻存管内，每个1~1.5ml 4. 将冻存管口封严 5. 贴上标签，注明冻存时间、细胞种类及代数 6. 按下列顺序降温，并最终冻存：室温→ 4℃ 20min → -20℃ 30min →-70℃冻存 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 细胞生物学实验经验 | 医学经典搜集 | 细胞培养技术 | 细胞培养技术与工艺 |
| 见好就收 | 生物材料相关 | 实验交流 | Enjoy my life！ |
| 日用 | 细胞培养 |
» 猜你喜欢
请教下大家口腔唾液菌群怎么扩增培养？
已经有0人回复
-
Advanced Science投稿求助
已经有8人回复
-
皮肤及其附属器论文润色/翻译怎么收费?
已经有265人回复
-
重庆大学生物工程学院吉维课题组诚招2024年博士生
已经有9人回复
-
医学考研调剂
已经有1人回复
-
有没有发《临床合理用药》被退稿的小伙伴
已经有5人回复
-
《临床合理用药》投稿交流
已经有8人回复
-
口腔299求调剂，有学上能走就行，专业不挑
已经有1人回复
-
文献求助，急急急！！！！
已经有2人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 养细胞的技术，心得
已经有30人回复
- 【推荐】干细胞牛人
已经有11人回复
- 【分享】细胞培养技术个人总结1
已经有47人回复
- 【推荐】世界著名的生物技术公司
已经有41人回复
5楼2010-04-03 23:26:36
2楼2009-12-13 20:57:33
3楼2010-03-07 21:49:03
4楼2010-03-07 21:55:17
6楼2010-04-04 20:41:48
7楼2010-04-05 16:00:42
9楼2010-06-11 12:25:34
10楼2010-09-21 16:30:28
11楼2010-09-22 00:34:13
13楼2010-10-05 14:10:51
14楼2010-10-06 23:33:09
15楼2010-10-08 07:37:04
16楼2010-10-08 09:32:48
17楼2010-10-08 19:56:46
18楼2010-10-09 20:55:13
19楼2010-10-11 08:37:26
20楼2010-10-11 09:20:38
21楼2010-10-21 16:41:18
22楼2010-11-01 14:50:29
23楼2010-11-01 21:19:57
24楼2010-11-02 11:42:29
25楼2012-02-25 15:47:54
26楼2012-03-20 10:35:15
|
本帖内容被屏蔽 |
28楼2012-04-09 20:21:00
29楼2012-04-28 14:26:49
 本帖仅楼主可见 |
30楼2012-05-12 20:20:20
31楼2012-05-13 15:19:28
33楼2012-05-24 23:42:40
34楼2012-06-04 00:20:06
36楼2012-07-01 21:04:40
37楼2012-09-26 14:03:43
39楼2013-04-18 10:57:05
40楼2013-05-09 13:19:39
42楼2013-07-18 10:21:49
43楼2013-08-29 11:00:50
45楼2014-03-17 15:29:52
46楼2014-05-12 15:57:34
47楼2014-08-05 15:49:55
48楼2014-09-18 12:11:55
50楼2015-03-14 15:54:21
简单回复
2010-06-06 10:13
回复
wyl_080612楼
2010-09-30 11:55
回复
mahu___27楼
2012-04-09 19:42
回复
五星好评 顶
purpleroses32楼
2012-05-20 20:50
回复
五星好评 谢谢分享
KING0703102835楼
2012-06-04 22:34
回复
三星好评
haiyanciniao38楼
2012-12-28 13:37
回复
三星好评
晴空一鹤00141楼
2013-06-19 16:51
回复
五星好评 顶
子然紫凝44楼
2014-03-10 14:05
回复
五星好评 
jokaing49楼
2014-09-18 14:01
回复
感谢分享 [ 发自小木虫客户端 ]
