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【原创】细胞培养技术自己的总结
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贴壁细胞传代培养相关技术 （一）器材设备 培养瓶，吸管，橡皮头，离心管，广口瓶，滤器（大小），针管，冻存管，高压消毒器，培养箱，无菌工作台，CO2气罐，相差倒置显微镜，4℃冰箱，20℃冰箱，pH调节仪 （二）试剂配制 1）培养基的配制 使用前，加入小牛血清，使其浓度为10% 2）PBS配制（1000ml） NaCl 8.5g KCl 0.2g Na2HPO4•12H2O 2.85g KH2PO4 0.27g 上述试剂称量后加入800ml双蒸水中，搅拌至完全溶解，调节pH=7.2，用1000ml量筒定容，过滤除菌，4℃保存 3）胰酶配制 配制PBS液体100ml，0.25g胰酶（粉剂），EDTA 0.02g 加入其中，搅拌至完全溶解（约4小时，期间放入4℃冰箱一次，全程冰袋保护），调节pH=7.5，然后放入冰箱4℃过夜，次日过滤（或次日再调pH值过滤） 4）抗生素配制 80万单位青霉素+4ml PBS 100万单位链霉素+5ml PBS后取出4ml加入上述青霉素液中，充分混合之后，8ml液体分装，-20℃保存，每99ml培养基中加入青链霉素混合液0.1ml，其终浓度青霉素100u/ml；链霉素100ug/ml 5）冻存液配制 DSMO加入小牛血清，DSMO浓度为10%；注意，DSMO要避光保存。 （三）操作步骤 准备工作 试剂的准备（见试剂配制部分） 设备及器材的准备 确保操作台洁净，所用物品经过高压或者其他方式消毒 细胞复苏 1. 将冻存的细胞取出后迅速放入37℃水浴中，并不时摇动，在一分钟内使其完全融化 2. 将细胞吸出放入有培养基的离心管中中，用滴管轻轻吹打混匀，800转/min，5分钟离心；弃去上清液，加入培养基，混匀再离心一次，弃液，加入4~5ml 培养基，混匀，移入培养瓶中 细胞换液 1. 用旧液体轻轻冲洗培养瓶底，然后用滴管吸尽旧液（弃去） 2. 加入PBS1~2ml，轻轻摇晃，然后用滴管吸尽旧液（弃去） 3. 如果细胞液比较脏，可以重复步骤2 4. 加入新培养基，轻轻摇匀，放入培养箱继续培养 细胞传代 1. 用旧液体轻轻冲洗培养瓶底，然后用滴管吸尽旧液（弃去） 2. 加入PBS1~2ml，轻轻摇晃，然后用滴管吸尽旧液（弃去） 3. 加入约1~1.5ml胰酶，室温或培养箱中放置4~5分钟，直到所有贴壁细胞消化下来为止【判断方法：倒置相差显微镜观察，细胞变圆时就可以终止消化】 4. 加入约1ml培养基（含有小牛血清）终止消化 5. 用滴管吹洗一次，移入离心管, 800转/min，5分钟离心 6. 加入培养基，吹打分散细胞，再根据分传细胞瓶数补加一定量的含血清的培养基，制成细胞悬液；分装至2~3个培养瓶中 7. 放入培养箱进行培养 细胞计数 1. 准备好显微镜、载玻片、盖玻片、血细胞计数板、吸管等仪器设备 2. 按照“细胞传代”中讲述的方法制成细胞悬液 3. 将细胞悬液取出若干，滴入血细胞计数板，注意不要有气泡进入 4. 加样后静置2~3min后观察，数四角大格内的细胞总数。计数时应按照一定的路径，以免遗漏或重复。细胞压线时计上不计下，计左不计右，计数2~3次，取平均值 5. 细胞密度 = 四大格中细胞总数÷4 ×104 = 细胞数/ml悬液 细胞冻存 1. 重复“细胞传代”中的消化细胞的步骤，将细胞消化下来，转移至离心管800转/min，5分钟离心，弃液 2. 沉淀中加入冻存液，轻吹制成悬液 3. 分转到冻存管内，每个1~1.5ml 4. 将冻存管口封严 5. 贴上标签，注明冻存时间、细胞种类及代数 6. 按下列顺序降温，并最终冻存：室温→ 4℃ 20min → -20℃ 30min →-70℃冻存 |
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