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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求救PCR高手
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axiaoru

[交流] 【求助/交流】求救PCR高手

我提的总RNA质量很好，可是按照说明书做反转录和简并引物PCR好多次，一条带都没出来过，会是什么原因呢？
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1楼 2009-12-07 12:52:03
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tianpingpe

新虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+4,VIP+0): 12-7 13:00
1.检查你的简并引物设计是否合理，重新设计简并引物
2.降低rna的量，模板量太高有的时候也扩增不出来。
3.检查rna是否有部分降解
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2楼2009-12-07 12:59:45
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你好
可能原因：
1.反转录的时候出问题了，也就是你合成CDNA第一链的时候，反转录效率不高，或者说不完全，反转的杂片段多
2.既然说了你的RNA质量不错，那RNA应该不会降解!
3.你不是有EST的序列么？设计个特异的引物看看，跑得出来不
4.PCR的时候注意跑TD，这个是关键
希望对你有帮助~
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3楼2009-12-07 13:16:18
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swellow

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
估计还是因为设计的问题，注意选择保守区进行设计
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4楼2009-12-07 16:07:42
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高海洁

新虫 (初入文坛)
长见识的
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5楼2009-12-07 16:58:18
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won7

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1，用内参（如beta actin）检测反转录的效果。
2，如引物兼并碱基较多，建议采用高纯度的合成方法。
3，如目的基因GC含量高，PCR时加二甲基亚砜至终浓度10％。
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6楼2009-12-07 17:13:56
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axiaoru

引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2009-12-7 13:16:
你好
可能原因：
1.反转录的时候出问题了，也就是你合成CDNA第一链的时候，反转录效率不高，或者说不完全，反转的杂片段多
2.既然说了你的RNA质量不错，那RNA应该不会降解!
3.你不是有EST的序列么？设计个特异 ...

多谢指教！引物不会有问题，因为两个月前有人用它扩出来了。第一条可能是我的问题。
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7楼2009-12-08 14:42:32
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axiaoru

引用回帖:
Originally posted by won7 at 2009-12-7 17:13:
1，用内参（如beta actin）检测反转录的效果。
2，如引物兼并碱基较多，建议采用高纯度的合成方法。
3，如目的基因GC含量高，PCR时加二甲基亚砜至终浓度10％。

多谢了，您提的都是很细致的问题。
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8楼2009-12-08 14:44:20
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