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axiaoru

[交流] 【求助/交流】求救PCR高手

我提的总RNA质量很好,可是按照说明书做反转录和简并引物PCR好多次,一条带都没出来过,会是什么原因呢?
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swellow

新虫 (初入文坛)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
估计还是因为设计的问题,注意选择保守区进行设计
4楼2009-12-07 16:07:42
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tianpingpe

新虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+4,VIP+0): 12-7 13:00
1.检查你的简并引物设计是否合理,重新设计简并引物
2.降低rna的量,模板量太高有的时候也扩增不出来。
3.检查rna是否有部分降解
2楼2009-12-07 12:59:45
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liyong1981

金虫 (正式写手)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
你好
可能原因:
1.反转录的时候出问题了,也就是你合成CDNA第一链的时候,反转录效率不高,或者说不完全,反转的杂片段多
2.既然说了你的RNA质量不错,那RNA应该不会降解!
3.你不是有EST的序列么?设计个特异的引物看看,跑得出来不
4.PCR的时候注意跑TD,这个是关键
希望对你有帮助~
3楼2009-12-07 13:16:18
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won7

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
1,用内参(如beta actin)检测反转录的效果。
2,如引物兼并碱基较多,建议采用高纯度的合成方法。
3,如目的基因GC含量高,PCR时加二甲基亚砜至终浓度10%。
6楼2009-12-07 17:13:56
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