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cornerqian

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】糖蛋白SDS-PAGE后跑不出条带,这是为什么啊?---继续求助!急!

我的糖蛋白分子量在200kd左右,SDS-PAGE分离胶用的是8%的,可是总是跑不出东西,(不同方法提取的糖蛋白)有的样品跑完之后没有任何东西, 有的整个泳道内都是蓝色,就是没有条带,这是为什么呢?上样buffer用的是2×的,缓冲液都重新配过了也不行。另外,染色液有点配浅了,不知道有没有影响。请大家给予帮助。非常感谢!
之后又用5%和6%的胶跑,还是没有东西,8%和10%的跑过之后还是整个泳道内都是蓝色,高碘酸-希夫试剂(PAS)染色也不见有糖蛋白条带,到底是怎么回事啊?是样品中盐的影响吗?再过分子筛纯化糖蛋白会好点吗?急需大家帮助!万分感谢!

[ Last edited by cornerqian on 2009-12-19 at 22:11 ]
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xuezhen

银虫 (小有名气)

★ ★
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amisking(金币+1,VIP+0): 12-7 20:27
跑胶之前是不是需要把蛋白样品变性一下,有跑marker嘛?有带嘛?是否需要配两种胶,浓缩胶加分离胶或许有效果点。
2楼2009-12-06 21:50:35
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cornerqian

木虫 (小有名气)

蛋白变性了,有marker,而且有条带,浓缩胶6%的,分离胶8%,除了marker我的样品都跑不出来,可能分子量太大了,结构也复杂,所以难跑。不知道有没有更好的解决办法,或者是不是糖蛋白不太适合用SDS-PAGE啊?
3楼2009-12-06 22:58:49
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tianpingpe

新虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★
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amisking(金币+3,VIP+0): 12-7 20:27
会不会是你的蛋白浓度比较低呢,增加你的蛋白的量吧,你的maker是正常的话,那么可能是你的蛋白量比较低。延长下你的电泳时间。
4楼2009-12-07 10:45:51
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sxc_lover

铜虫 (小有名气)

百分之八的非变性胶跑8个小时

★ ★
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amisking(金币+1,VIP+0): 12-7 20:27
用百分之八的非变性胶跑8个小时试一试,记得点MARKER ,你的分子量太大,你跑的是大板的吗?
新手上路 多多指教
5楼2009-12-07 12:51:37
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cornerqian

木虫 (小有名气)

我用的是小板的,非变性胶跑8h的话,电压要调多少才能在8h内跑完呢?(我用的是稳压,浓缩胶80v,分离胶160v)对了,我们用的电极缓冲液是:tris 3g;甘氨酸 14.4g;SDS 0.5g,定容到100ml,用时在稀释10倍。我看网上有定容到500ml的,这个有影响吗?其实我是想要糖蛋白的蛋白部分,可是糖蛋白没跑出来,不敢用酶切蛋白后跑电泳,酶太贵了,要是切完跑还是这样更郁闷了。
6楼2009-12-07 15:18:20
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cornerqian

木虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by sxc_lover at 2009-12-7 12:51:
用百分之八的非变性胶跑8个小时试一试,记得点MARKER ,你的分子量太大,你跑的是大板的吗?

我用的是小板的,非变性胶跑8h的话,电压要调多少才能在8h内跑完呢?(我用的是稳压,浓缩胶80v,分离胶160v)对了,我们用的电极缓冲液是:tris 3g;甘氨酸 14.4g;SDS 0.5g,定容到100ml,用时在稀释10倍。我看网上有定容到500ml的,这个有影响吗?其实我是想要糖蛋白的蛋白部分,可是糖蛋白没跑出来,不敢用酶切蛋白后跑电泳,酶太贵了,要是切完跑还是这样更郁闷了。
7楼2009-12-07 20:17:56
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

浓缩胶6%浓度太高了。
8楼2009-12-08 08:42:08
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qiang84zhang

银虫 (正式写手)

你的蛋白的分子量太大了,你的MARKER是多大的?
只能把胶的浓度再降些!否则,蛋白根本就跑不动,200,太大了!
9楼2009-12-08 09:23:41
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烟大考研

金虫 (正式写手)


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我们的也是糖蛋白,分子量在80kd左右,用的浓缩胶5%,分离胶12%,楼主的用8%的胶跑200kd的应该没有问题,出现泳道内全是蓝色的情况是你的蛋白发生了降解,或者蛋白抽提的不纯,建议楼主将你们提取的蛋白过一下分子筛,然后再浓缩一下,用上样Buffer稀释到0.5mg/ml上样20ul
心信其可行,则移山填海之难,终有成功之日;心信其不可行,则反掌折枝之易,亦无收效之期
10楼2009-12-08 09:32:29
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